云南白药及其活性成分三七总皂苷对肠吻合口的作用研究

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目的通过动物实验,观察腹腔内肠吻合口旁局部使用云南白药及三七总皂苷对吻合口愈合的影响;体外观察云南白药水溶物的抑菌和抗肿瘤作用;初步探索云南白药及三七总皂苷能够促进肠吻合口的愈合。方法第一部分:动物实验观察云南白药及三七总皂苷对肠吻合口愈合作用的影响。取SD大鼠45只,行肠切除、肠吻合术,采用单层间断内翻缝合法行肠管端端吻合,检查无漏后抽签随机分为空白对照组、云南白药组与PNS组。予吻合口旁:对照组喷涂生理盐水,云南白药组喷涂云南白药,PNS组喷涂PNS。分别于术后第3、5、7天各组大鼠麻醉处死5只,大体观察肠吻合口吻合情况,有无吻合口漏、局部炎症反应及腹腔粘连情况;检测各组吻合口爆破压、羟脯氨酸含量及吻合口组织HE染色、Masson染色、VEGF/CD31免疫组化组织学改变,评价两种药物对吻合口的影响。第二部分:云南白药水溶物的抑菌作用研究。配置不同浓度的云南白药水溶物(1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml、0.125g/ml、0.0625g/ml),各药物组浸泡直径6mm圆形灭菌纸片,并过夜。阴性对照组纸片浸泡于无菌生理盐水中。将纸片置于接种有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念球菌的培养皿中,观察抑菌环的大小,评价云南白药水溶物对四种细菌的抑制作用,间接证明云南白药的促吻合口愈合的作用。第三部分:云南白药水溶物的抗肿瘤作用研究。取前期配制的不同浓度的云南白药水溶物,SW480细胞悬液200μl接种于96孔板内,设一个空白对照组和4个药物实验组,每组设4个副空,细胞培养24小时后将不同浓度的药物20μl加入实验组,置于370C培养箱中继续培养,分别于细胞培养24h后加入MMT20μl,观察不同浓度的云南白药水溶物作用细胞培养24小时后细胞的生存率状况。结果1、大鼠麻醉效果满意,以5-0医用可吸收线吻合肠管,针距约0.1cm,共缝合8-10针,缝合完毕后肠管注水均未见渗漏。吻合口处喷涂云南白药/PNS均匀,效果满意。手术顺利,用时约30-40min。2、吻合口情况:术后第3天肠吻合口处血供良好,肠管见轻微充血水肿。术后第5天吻合口愈合良好,周围见少量疤痕组织生成。术后第7天吻合口处见大量疤痕组织,与肠系膜有轻微粘连。吻合口处均未见云南白药/PNS残留,药物吸收完全。3、腹腔粘连情况:各组大鼠均具有不同程度的粘连,术后第5天云南白药组大鼠腹腔粘连指数明显高于对照组(p<0.05),云南白药组术后第3、7天腹腔粘连指数高于PNS组与对照组(p>0.05);PNS组术后第3、5、7天腹腔粘连指数均高于对照组(p>0.05)。4、爆破压情况:术后第3天,云南白药组吻合口爆破压明显高于对照组(p<0.05),同时也高于PNS组(p>0.05),PNS组高于对照组(p>0.05);随着时间的推移,各组吻合口爆破压成升高趋势,术后第5天,云南白药组明显高于对照组与PNS组(p<0.05),PNS组吻合口爆破压稍高于对照组(p>0.05)。术后第7天,云南白药组与PNS组均明显高于对照组(p<0.05)。5、羟脯氨酸测定:术后对照组、云南白药组及PNS组的HYP均随着时间的推移缓慢升高。术后第3、5、7天,云南白药组均高于PNS组和对照组(p<0.05);术后第3、5天PNS组也明显高于对照找组(p<0.05);术后第7天,PNS组稍高于对照组(p>0.05)。6、HE染色观察:随着时间的推移,各组吻合口炎症逐渐减弱,云南白药组表现较为明显。术后第5天,云南白药组的炎症反应程度明显低于PNS组和对照组(p<0.05)。7、Masson染色:胶原纤维呈蓝色,肌肉、纤维素呈红色,胞核黑蓝色。术后第3天,各组吻合口组织均见少量的胶原纤维,且可见胶原纤维比较纤细、杂乱无章,随着时间的推移,胶原合成越来越多,且其排列方向呈现一定的趋向性。同时期相比,云南白药组吻合口组织胶原含量明显高于对照组和PNS组,胶原纤维较粗大、致密,且趋向性更加明显。PNS组较对照组也表现轻微优势。8、CD31/VEGF免疫组化结果:随着时间的推移,各组CD31/VEGF阳性表达细胞呈逐渐升高趋势,前期,云南白药组升高最为明显。同期相比,术后第3、5天,云南白药组明显高于PNS组和对照组,PNS组高于对照组。术后第7天,云南白药与PNS的促血管生成作用优势稍减弱。9、培养24h后,云南白药水溶物对四种细菌的生长均表现一定的抑制作用,其中1g/ml云南白药水溶物对金黄色葡萄球菌抑制作用最为明显。10、不同浓度的云南白药水溶物作用细胞24h后对SW480细胞均具有一定的抑制作用,且IC50为0.27g/ml。结论1、局部使用云南白药或PNS,在胃肠吻合口愈合的前期具有明显的促进作用,且云南白药的效果优于PNS2、云南白药粉剂不宜直接应用到肠管浆膜面。3、云南白药水溶物能够抑制金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等细菌的生长,预防吻合口处局部感染。4、云南白药水溶物对结肠癌SW480细胞具有一定的抑制作用,且具有浓度依赖性。
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