盐胁迫下盐地碱蓬甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的功能分析

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高等植物体内的多不饱和脂肪酸合成途径分为真核途径和原核途径。原核途径是指在叶绿体中存在的途径,真核途径是指内质网中甘油脂的合成以及向叶绿体的转运。在这两种途径中,由饱和脂肪酸形成磷酸酯(PA)这一过程中都需要甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)的催化作用,进而由磷酸酯(PA)合成磷脂酰甘油(PG),即甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是磷脂酰甘油合成过程中的第一个酰基酯化酶。  本研究从盐地碱蓬叶片中分离得到叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。同时研究了盐胁迫对拟南芥GPAT缺失突变体的影响。主要研究结果如下:  1.利用拟南芥、番茄、菠菜、甜菜等植物中已知的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因设计一对简并引物。通过PCR的方法从盐地碱蓬叶片中克隆甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的中间片段,再通过5 RACE和3 RACE技术克隆得到5片段和3片段,拼接全长后设计两端特异引物进行全长克隆。该基因编码区全长1167 bp,编码388个氨基酸,分子量约为43 kDa。经过同源序列比对后发现,盐地碱蓬叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因与菠菜的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因同源性最高,达到87%。  2.将获得的盐地碱蓬甘油-3-磷酸酰基转移酶基因与pB7WG2D载体重组,构建正义表达载体,利用花序侵染法获得拟南芥过表达株系。以叶片DNA为模板,根据表达载体上的35S启动子序列设计引物与基因3端引物进行PCR扩增,检测过表达株系。  3.在盐胁迫下,野生型拟南芥与过表达株系的萌发率、主根长度都受到了抑制,但是过表达株系受到的抑制程度较低,说明在萌发期过表达株系的抗盐能力更好;用RT-PCR检测过表达株系中盐地碱蓬甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的表达量,发现在100 mM NaCl条件下,表达量最高。用0和100 mM NaCl处理幼苗期的植株,测定叶片中的叶绿素含量、光合荧光参数和光系统I活性,结果发现,在盐处理下,过表达株系的叶绿素含量、ΦPSII、Fv/Fm及PSI活性显著高于野生型拟南芥,Fo、1-qP和 NPQ显著低于野生型拟南芥。这说明与野生型相比,过表达株系受到盐胁迫的抑制作用更小,光合能力更强。通过测定PG脂肪酸组成发现,过表达株系PG中不饱和脂肪酸的含量显著高于野生型拟南芥。  4.选取SALK_136675C(ATGPAT6),SALK_060056(ATGPAT2),SALK_037660C(ATGPAT1),SALK_045942(ATGPAT4)这四个突变体进行实验,结果发现,SALK_136675C和SALK_060056这两个突变体的抗盐能力显著低于野生型。盐处理下,SALK_136675C和SALK_060056的萌发率及主根长度显著低于野生型拟南芥。测定了幼苗期100 mM NaCl条件下SALK_136675C,SALK_060056和野生型拟南芥的叶绿素含量、各叶绿素荧光参数和光系统 I活性参数,结果发现,在盐处理下,SALK_136675C和SALK_060056叶片中的叶绿素含量、ΦPSII、Fv/Fm及PSI活性显著低于野生型植株,Fo、1-qP和NPQ显著高于野生型植株。这些结果说明,SALK_136675C和SALK_060056的光系统受到盐胁迫的伤害更大。与野生型拟南芥相比,SALK_136675C和SALK_060056叶片中PG中不饱和脂肪酸的含量明显减少。  上述结果表明,盐地碱蓬叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因能够通过提高PG不饱和脂肪酸的含量来增强拟南芥的抗盐能力。
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