论文部分内容阅读
背景 肌腱蛋白C(Tenascin-C,TNC)是细胞外基质糖蛋白,在细胞生长、增殖和分化中发挥着重要作用。在胚胎发育过程中,TNC大量表达,此外,当器官损伤时TNC表达也会上调。TNC在正常成人肾脏中表达很少或没有表达,但在慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)中具有很强的表达。以前的报道表明TNC的过表达与组织修复和肾脏纤维化高度相关。通过结合整合素或Toll样受体(TLR)的表面受体,TNC对成纤维细胞存活,炎症细胞迁移和干细胞或祖细胞龛的形成发挥着重要的影响。然而,TNC在急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)中的作用尚未阐明,因此,在本研究中,我们观察TNC在急性肾损伤中的作用,并阐述其作用机制。方法 体内实验是分别建立了甘油、双侧缺血再灌注损伤和顺铂模型,观察TNC在这三个AKI模型中的表达;并对AKI病人的肾穿刺活检标本进行染色,观察TNC在AKI病人中的表达。建立双侧缺血再灌注损伤和顺铂模型,并运用TNC的干扰质粒来沉默TNC的表达后,用全自动化生化分析仪检测血清肌酐和尿素氮;PAS染色检测肾小管损伤;免疫组化检测TNC、Cleaved caspase-3和β-catenin的表达;TUNEL检测细胞核凋亡;RT-PCR检测19个Wnt mRNA的表达;Western-blot 检测 TNC、Cleaved caspase--3、Bax、KIM-1、wntl、wnt5b、wnt10b和β-catenin的表达。体外实验是通过培养HKC-8细胞,分别用Staurosporine(STS)和顺铂(Cisplatin)来诱导其凋亡,加用TNC重组蛋白进行孵育,流式细胞仪和TUNEL检测凋亡;Westeer-blot检测Cleaved caspase-3、Bax、Fas1、P53、wnt1、active β-catenin、PCNA 和 Survivin 的表达;免疫荧光检测PCNA的表达。转染Wnt1过表达质粒,加TNC重组蛋白进行孵育,Westem-blot检测active β-catenin的表达;分别提取核蛋白和胞浆蛋白,Western-blot检测核蛋白和胞浆蛋白中β-catenin的表达;免疫共沉淀分别检测Wnt1和Wnt4与TNC的相互作用;双重荧光素酶报告基因检测TNC对Wnt/β-catenin信号通路的转录和调控。结果 在体内实验中,Western blot检测结果表明,TNC蛋白水平在甘油造模后30h显著升高。免疫组化染色提示在IRI模型中,TNC在皮髓质交界部位的肾间质明显上调;RT-PCR结果发现,IRI组小鼠的TNCmRNA在术后6h开始上调,12h显著升高,术后24h仍持续表达;顺铂模型组小鼠TNC mRNA的表达水平在顺铂腹腔注射给药后第1天开始升高,第2天明显升高,第3天仍持续表达。同时,免疫组化提示TNC在AKI病人的肾活检标本中明显上调。在IRI和顺铂模型中,TNC的干扰质粒沉默TNC后,Western-blot和免疫组化均提示肾间质TNC表达明显减少;血肌酐和尿素氮升高,PAS染色提示大量刷状缘脱落,小管上皮细胞缺失,管腔形成;Western-blot提示凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Bax表达上调,KIM-1表达增加,增殖相关蛋白p-AKT表达减少,wnt1、wnt5b、wnt10b和β-catenin蛋白的表达减少;RT-PCR提示12个WntmRNA的表达不变;免疫组化提示Cleaved caspase-3表达上调,β-catenin表达减少;TUNEL染色提示细胞核凋亡数目增加。细胞实验表明TNC重组蛋白对STS和顺铂诱导的HKC-8凋亡具有很明显的保护作用,Western-blot提示凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-3、Bax、FASL 和 P53 表达减少,wnt1 和 activeβ-catenin信号通路相关蛋白的表达明显增加,Survivin和PCNA增殖蛋白的表达也明显增加;流式和TUNEL均提示凋亡明显减轻,免疫荧光提示PCNA表达增加。此外,转染Wnt1过表达质粒并加TNC重组蛋白孵育后,Western-blot检测结果提示,activeβ-catenin的蛋白表达明显增加,核蛋白中β-catenin的表达明显增加,胞浆蛋白中β-catenin的表达明显减少,免疫共沉淀表明Wnt1和Wnt4能分别与TNC相互作用,双重荧光素酶报告基因提示TNC对Wnt/β-catenin信号通路存在转录和调控。结论(1)在急性肾损伤中TNC的表达迅速上调,而TNC的上调起保护作用;(2)TNC在急性肾损伤中的保护作用是通过促进Wnt/β-catenin信号通路来实现的。