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叶绿体基因工程是高效表达外源蛋白的有效途径之一。与核转化技术相比,具有许多优点：如基因拷贝数多,表达率高,遗传性状稳定,生物安全性高,能够避免基因沉默和位置效应等。翻译效率是决定表达能力的关键因素,一些翻译增强子能明显提高重组蛋白的表达。来源于T7噬菌体基因10前导序列(g10-L)的一段九个碱基的翻译增强子序列(UUAACUUUA)已被证实在大肠杆菌中能明显提高多种外源基因表达产量达40～340倍,其原理可能是增强mRNA与16S核糖体的识别结合能力进而促进翻译。实现叶绿体转化需要一个有效的转化载体,这种转化载体中必须具备几个基本元件：同源重组的同源臂、完整的外源基因表达盒(包括启动子、目的基因和调控序列)、筛选标记基因。Lux Ct是以荧光素酶基因Lux AB为基础进行适当改造而成,含有高效的内源性atpA基因启动子及5’UTR和3’UTR,表达盒为atpA5’UTR-gfp基因-rbcL3’UTR。 LuxCt为一种穿梭载体,既可以在原核生物中表达,也可以在真核生物中表达,但是不能进行诱导表达。肿瘤的生长和转移是血管生成依赖性过程。Canstatin是近年来新发现的一种内源性血管生成抑制因子,为Ⅳ型胶原α2链的非胶原区。在体外,它能抑制血管内皮细胞的增生、迁移,从而诱导内皮细胞凋亡；在体内,能有效抑制肿瘤的生长。目前,通过抑制血管生成的这种“休眠疗法”在临床应用上具有更广阔的应用前景。我们在本研究中构建含有人Canstatin的重组表达载体,通过检测Canstatin蛋白表达量的变化来验证g10-L翻译增强序列提高外源蛋白表达的功能。方法我们首先根据Genbank上登录的人Canstatin cDNA序列设计引物,以提取的人非小细胞肺癌A549细胞总RNA为模板,利用RT-PCR的方法克隆出人Canstatin基因全长,以及分别在5’UTR下游和3’UTR上游添加了g10-L翻译增强序列(UUAACUUUA)的人Canstatin基因片段,并将其分别克隆在pMD18-T载体上并用PaeR7I、SphI进行酶切鉴定。然后利用酶切、连接等方法将表达盒为atpA5’UTR-gfp基因-rbcL3’UTR的Lux Ct构建成表达盒为atpA5’UTR-canstatin基因-rbcL3’UTR的人Canstatin叶绿体表达载体,同时分别构建在5’UTR下游和3’UTR上游添加了g10-L翻译增强序列的叶绿体表达载体,并用PaeR7I、SphI进行酶切鉴定。之后为了能够分别在5’UTR上游和3’UTR下游添加g10-L翻译增强序列,对第一部分的实验进行补充,我们又采用一种新的方法。以构建好的不添加g10-L翻译增强序列的表达盒为atpA5’UTR-canstatin基因-rbcL3’UTR的重组载体为模板,设计两对引物进行PCR,分别扩增得到在5’UTR上游、3’UTR下游添加g10-L翻译增强序列的atpA5’UTR-canstatin基因-rbcL3’UTR片段。之后分别连接在pMD18-T载体上并用AvaI、SphI进行酶切鉴定,则分别在5’UTR上游、3’UTR下游添加g10-L翻译增强序列的原核表达载体构建完成。最后,将构建好的重组表达载体分别在大肠杆菌DH5a中进行原核表达,提取蛋白,并用western blotting的方法进行检测,初步验证g10-L翻译增强序列(UUAACUUUA)提高外源蛋白表达的功能。结果1.人Canstatin基因片段以及分别在5’UTR下游、3’UTR上游添加g10-L翻译增强序列(UUAACUUUA)的人Canstatin基因片段的扩增用TRIzo1试剂提取A549细胞总RNA,28S和18S条带清楚,说明纯度较高。利用RT-PCR方法得到700bp左右的人Canstatin基因全长以及添加了g10-L翻译增强序列的人Canstatin基因片段,并且克隆在pMD18-T载体上,酶切鉴定正确。2.人Canstatin叶绿体表达载体以及分别在5’UTR下游、3’UTR上游添加g10-L翻译增强序列(UUAACUUUA)的人Canstatin叶绿体表达载体的构建利用酶切、连接的方法构建了表达盒为atpA5’UTR-canstatin基因-rbcL3’UTR的人Canstatin叶绿体表达载体,同时分别构建在5’UTR下游和3’UTR上游添加了g10-L翻译增强序列的人Canstatin叶绿体表达载体,并经酶切鉴定说明构建成功。3.补充构建分别在5’UTR上游、3’UTR下游添加g10-L翻译增强序列(UUAACUUUA)的人Canstatin原核表达载体按照上述方法进行构建,经酶切鉴定结果表明分明在5’UTR上游、3’UTR下游添加g10-L翻译增强序列的表达盒为atpA5’UTR-canstatin基因-rbcL3’UTR的原核表达载体构建成功,对第一部分载体的构建进行了补充。同时也构建了不添加翻译增强序列以及分别在5’UTR下游、3’UTR上游添加g10-L翻译增强序列的人Canstatin原核表达载体。4.人Canstatin蛋白的原核表达以及western blotting检测将两组构建好的重组表达载体分别在大肠杆菌DH5α中进行原核表达,提取蛋白,之后进行western blotting检测。结果显示在24KDa处出现特异性条带,并且添加了g10-L翻译增强序列的表达载体的条带要强于没有添加翻译增强序列的表达载体的条带,说明蛋白表达量有所提高。可以初步说明g10-L增强序列(UUAACUUUA)对外源蛋白的表达有增强作用。结论1.本研究成功构建了人Canstatin叶绿体表达载体以及分别在5’UTR下游、3’UTR上游添加了g10-L翻译增强序列的人Canstatin叶绿体表达载体。2.本研究成功构建了人Canstatin原核表达载体以及分别在5’UTR上游下游、3’UTR上游下游添加了g10-L翻译增强序列的人Canstatin原核表达载体。3.Western blotting检测的结果表明g10-L翻译增强序列(UUAACUUUA)对外源蛋白的表达有提高作用。