肿瘤是严重危害全球人类生命健康的常见病之一。抗微管类药物在治愈性和姑息性化疗方案中的广泛应用，尤其是泰素在临床肿瘤治疗学中的成功应用，再次激起了人们对微管作为化疗细胞靶点的浓厚兴趣。微管参与有丝分裂过程。它是由两种微管蛋白（α亚基和β亚基）紧密连接形成异源二聚体。正常情况下，微管和微管蛋白异源二聚体之间存在动态平衡，其平衡与有丝分裂和细胞增殖相关，而平衡的方向受到多种因素调控。 抗微管类化疗药物主要包括紫杉醇、泰素帝、长春碱和长春新碱和诺维本。紫杉醇是一种来源于红豆杉树皮内的新型抗微管类化疗药物，它已被广泛应用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、食管癌等。紫杉醇可促进微管蛋白形成微管，抑制微管的解聚，促进微管双聚体形成、阻止其多聚化，导致纺锤体异常并抑制有丝分裂而使细胞阻滞于G₂/M期，进而诱导细胞凋亡。另外在临床上已经广泛地将长春碱、长春新碱用于治疗白血病、淋巴瘤以及其它一些实体肿瘤。另一类抗微管类化疗药物如长春类生物碱，能在受体部位与纺锤微小管蛋白的结合，形成高度规则的结晶体从而影响微管蛋白装配，使细胞阻滞于G₂/M期。近年来，多个实验室已经证实抗微管类化疗药物能诱导包括乳腺癌、卵巢癌在内的多种实体肿瘤细胞形成特异性的约为180bp大小“DNA梯状凋亡条带”（DNA ladder）和特有的凋亡形态变化。这些结果表明除了经典的抗微管和细胞周期阻滞之外，它们还通过诱导细胞凋亡进而杀伤肿瘤细胞。由于其作用于微管的机制不同，诱导细胞凋亡的信号传导途径也肯定有所不同。但至目前为止，抗 浙江大学博士学位论文微管类化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的分子机理尚不清楚。我们己有的实验结果证明核因子火a卯paB 小F－。B)信号传导途径参与抗微管类化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡。 NF－xB是一种Rel转录因子家族，主要位于胞浆中以非活化形式与抑制蛋白T。B－a结合形成复合物。NF－d与工。B－(共同参与调节炎症、免疫应答、细胞增生以及细胞凋亡。在受到相应的刺激后，lxB－a磷酸化降解，NF－xB则转移至细胞核。进入到胞核后，就能识别靶基因起始区特异性的序列，并与之结合，进一步增强、激活或诱导下游的靶基因的转录过程。而磷酸化降解I。B蛋白的关键酶是 I＊激酶（目 IKKa和 IKK6）。至目前为止，己经报道NF－xB与 150 不靶基因的转录有关，其中有许多基因与调节凋亡有关，例如 FAS／APOJ配体厂asLXC－m丁C，ICE以及p53等。根据细胞类型及刺激物的不同，N卜KB激活可诱导凋亡或阻滞凋亡的发生。 本研究旨在通过深入研究并阐明NF－KB途径在抗微管类化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡中的机制，明确NF－。B与G。川期阻滞的关系，了解NF－KB上下游与凋亡相关的基因水平变化。这将有助于深人了解抗微管类化疗药物诱导细胞凋亡的机制，随着其药理学的深入研究，将拓展其临床应用范围，并为阐明细胞生长。分化和凋亡提供理论基础。本研究从以下几个部分去探讨抗微管类化疗药物诱导实体肿瘤细胞凋亡的机制。 第一部分：突变 l仍－a基因对长春碱诱导乳腺癌细胞凋亡的影响 本研究为了探索1。B－a／NF－。B途径在长春碱类药物诱导肿瘤细胞凋亡中的作用。长春碱类药物能磷酸化降解IKB－。蛋白、诱导NF－。B的激活。以缺失”丝氨酸、’‘丝氨酸的突变I。B－a基因稳定转染乳腺癌BCap37细胞，观察长春碱类药物诱导肿瘤细胞凋亡的变化。突变kB－a不能被＊B激酶磷酸化降解，EMSAs结 果表明突变I。B－a能阻滞NF－。B激活。经DNA降解分析、流式细胞仪及MTT法检 测，表明它能抑制由长春碱类药物诱导的乳腺癌细胞凋亡。提示NF－XB／1d信号 转导途径参与介导长春碱类药物所诱导的肿瘤细胞凋亡反应，阻断或封闭该信号 转导途径将改变长春碱类药物所诱导的细胞凋亡。 第二部分：胚M1八 途径介导长春碱类药物诱导肿瘤细胞凋亡 8 浙江大学博士学位论文 以人乳腺癌BCan37细胞株及人表皮癌KB细胞株为对象，用DNA降解法、PI染色DNA含量检测法、EMSAS、蛋白免疫印迹法、免疫沉淀和激酶活性检测法来研究长春碱类药物诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导途径。长春碱类药物能诱导肿瘤细胞出现典型的凋亡梯状条带和乙川期阻滞，降解IK卜。蛋白，诱导呷－d的激活；可上调 IKB激酶（IKK酶）活性并诱导 MEKKI表达。提示长春碱类药物可诱导MEKKI表达，上调IKK酶活性，进而通过NF－KB／I忧途径参与介导长春碱类药物诱导的肿瘤细胞凋亡反应。MEKKI／IKK途径具有重要的作用。 第三部分：Partheno！i de抑制紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡 以人乳腺癌BCan37细胞和人表皮KB细胞为研究对象，使用结构上属于蓓半菇烯内脂、来源于艾菊的化合物Pa，thenolide，观察它对紫杉醇诱导细胞凋亡的影响。通过检测DNA凋亡梯状条带法及DNA含量，Par上henolide能显著抑制紫杉醇所诱导的 B