目的在世界范围内,肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种发病率及致死率均居于前列的实体恶性肿瘤,其具有病程进展迅速、发病隐匿的临床特点。手术切除是HCC的首选治疗方案,后期可联合应用经肝动脉介入栓塞化疗、射频消融术及口服分子靶向药物等。但是,HCC容易发生侵袭转移的生物学特性在一定程度上严重影响了其临床治疗的效果及患者的预期预后。因此,深入研究肝癌细胞的生物学特点及其潜在的分子机制对于充分认识HCC的临床发展过程、研究相关靶点药物及制定相应治疗方案具有重要意义。环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)在大多数体内正常细胞中处于不表达状态,或者仅是少量表达,不同于COX-1可在肾脏、胃等器官组织中的高表达。但是,IL-1、TNF-α、紫外线等炎症相关因子及促癌因素可以促进组织细胞中COX-2的蛋白或基因表达,进而参与体内的相关炎症反应或肿瘤的发生发展过程。大量的研究已经证实,在肝细胞肝癌、结肠癌、乳腺癌等多数的恶性实体肿瘤中,研究者均可检测到COX-2蛋白的高表达。在对其调控作用及分子机制的研究中发现,COX-2可以通过Akt等相关信号通路调节肿瘤内新生血管形成、肿瘤细胞的凋亡及侵袭迁移能力等与肿瘤的发生发展密切相关的生物学行为。诸多研究也表明,COX-2应是肿瘤分子治疗中不可忽视的重要靶点,且其在肿瘤细胞中的具体调控调节机制仍具有重要的研究价值。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是COX-2的主要代谢产物,其可以参与并介导COX-2涉及的体内诸多病理过程。众多前期研究发现,PGE2与结肠癌等部分实体恶性肿瘤的体积大小及临床病理分期等具有一定的相关性。同时也有研究发现,在发生了肝脏转移的结肠癌患者中,其血清中PGE2的水平可明显的高于未发生远处转移的患者,提示PGE2与结肠癌的侵袭转移能力相关,并为其作为早期预测结肠癌转移可能性的分子生物学标志物提供一定的实验理论依据。PGE2在肿瘤发生发展以及侵袭转移中的作用也已被人们广泛的认识,并进行了相关的深入研究。但是,随着肿瘤学研究的深入,越来越多涉及肿瘤侵袭转移的分子及相关机制被发现。因此,更深入研究PGE2参与的调控肿瘤迁移的分子机制,对于认识PGE2的生物学功能及肿瘤治疗相关分子靶点的选择具有重要的意义。美洛昔康(Meloxicam,Mel)是一类可用于类风湿性关节炎症状治疗的非甾体类抗炎药物,然而大量的研究证实,Mel在抗肿瘤治疗中也可发挥重要作用。我们的前期研究即证明,Mel可通过COX-2依赖/非依赖途径发挥其抗肝癌细胞的活性,但是Mel诱导的肝癌细胞自噬则在一定程度上拮抗其促肝癌细胞凋亡的作用,证实Mel在肝癌治疗中可能发挥双面调节作用,而进一步研究其相关调控机制尤为重要。而在肺癌、胃肠道恶性肿瘤中,Mel也可通过调节肿瘤细胞的凋亡、活力及迁移能力等发挥其抗肿瘤作用。其中,COX-2/PGE2是介导Mel活性的重要途径之一。侵袭迁移能力是影响恶性肿瘤治疗效果的重要因素之一,因此在前期大量研究基础上,进一步讨论Mel调节肿瘤侵袭迁移的机制,以及再次深入研究COX-2/PGE2途径在Mel抗肿瘤活性的作用,可对Mel类似药物的研发及临床治疗靶点的研究提供充分的实验理论依据。肿瘤内部环境复杂,其微环境中各种细胞及因子间相互作用调控,而探索参与肿瘤发展的相关分子机制对于理解其生物学特点及相关靶点药物的基础研究具有重要意义。我们选取COX-2选择性抑制剂美洛昔康作为研究对象,并探讨COX-2/PGE2途径在肝癌细胞迁移及介导Mel抗肝癌活性的作用,且在此基础上进一步深入研究讨论参与此调控途径的下游信号通路以及分子蛋白。我们希望能够为认识肝细胞肝癌的生物学特点、新的治疗靶点的研究选择以及Mel或者类似的COX-2抑制剂类药物的临床试验研究,提供一定的实验理论依据。方法1.选取五种常见人肝癌细胞系SMMC-7402、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721、HepG2,培养24小时后,提取细胞浆总蛋白,Western blot法检测五种肝癌细胞系中COX-2蛋白的表达水平,筛选出高表达COX-2的肝癌细胞系作为后续实验研究对象。2.在上述实验基础上,选取高表达COX-2蛋白的肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2作为实验研究对象。取对数生长期上述两种肝癌细胞系,首先用不同浓度的Mel(20 μM,40μM,80μM)处理培养24小时,后提取细胞培养上清液,运用ELISA法检测细胞上清中PGE2蛋白的表达水平。3.为了明确Mel对肝癌细胞活力的影响。我们把SMMC-7721、HepG2肝癌细胞系均给予Mel(20 μM,40 μM,80 μM)处理,在同一浓度处理时,然后分别在不同时间点(24 h,48 h,72 h),运用CCK-8法检测肝癌细胞的活力。4.继续以上述两种肝癌细胞系作为研究对象,此时我们选取Mel(80 μM)处理培养24小时,然后运用细胞周期检测试剂盒检测Mel对细胞周期的影响。为进一步探索Mel影响细胞周期的机制,继续上述培养处理方式,收集细胞浆总蛋白后Western blot法检测周期蛋白依赖激酶抑制剂p21与p27的蛋白表达情况。5.为明确Mel及PGE2在肝癌细胞迁移方面的影响,我们运用Transwell法,上室培养肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2,并分别给予如下处理:对照组,PGE2(10 μM)处理组,Mel(80μM)处理组,PGE2+Mel联合处理组,下室为含10%FBS的细胞培养基。48小时后,用95%的无水乙醇固定,1%结晶紫染色,在显微镜下观察迁移至下室肝癌细胞数量,并计数。6.探索COX-2在Mel调控肝癌细胞迁移中的作用,我们首先运用Mel(40μM,80μM)处理上述肝癌细胞系,用Western blot法检测COX-2蛋白表达。其次,我们选取COX-2的siRNA稳定转染肝癌细胞后,再次运用方法5中的Transwell法,实验分组为:对照组,对照siRNA组,COX-2 siRNA组,检测COX-2 siRNA对于肝癌细胞迁移能力的影响。7.为明确COX-2代谢产物PGE2与Mel在调控肝癌细胞迁移中的机制,我们首先把研究对象SMMC-7721、HepG2进行实验分组:对照组,PGE2(10 μM)处理组,Mel(80 μM)处理组,PGE2+Mel联合处理组,培养24小时后,Western blot法检测肝癌细胞中MMP2、MMP9及E-cadherin的蛋白表达情况。其次,在上述实验分组条件下,提取总RNA后,RT-PCR法检测两种肝癌细胞中MMP2、MMP9 及 E-cadherin 的 mRNA 表达情况。8.为探索是否存在中间信号通路或蛋白介导PGE2及Mel对于MMPs及E-cadherin的调节。我们在方法7中实验分组的基础上,培养24小时后,提取细胞核内的总蛋白,Western blot法检测Wnt信号通路中关键蛋白β-catenin的细胞核内表达情况,并同法检测GSK-3β的磷酸化水平变化。为进一步证实β-catenin在介导PGE2与Mel调控肝癌细胞迁移中的作用及相关机制,在后续实验研究中,我们选取HepG2作为研究对象,选取β-catenin的siRNA及对照siRNA分别稳定转染肝癌细胞,将上述转染后细胞进行实验分组:对照组,PGE2(10μM)处理组,Mel(80 μM)处理组,PGE2+Mel联合处理组,稳定培养24小时后,提取细胞浆总蛋白后Western blot法检测MMP2、MMP9及E-cadherin的蛋白表达情况。9.进一步明确β-catenin在调控及介导PGE2通路在肝癌细胞迁移中的作用,我们选取β-catenin特异性抑制剂FH535,并在Transwell板的上室中分别培养SMMC-7721、HepG2细胞,并给予如下处理:对照组,PGE2处理组(10μM),FH535处理组(5μM),FH535+PGE2处理组,下室为含10%FBS的细胞培养基,48小时后95%乙醇固定,1%结晶紫染色后,在显微镜下观察迁移入下室的肝癌细胞的数目,并计数。10.我们继续方法9中的实验分组方式,培养24小时后,提取细胞浆总蛋白,Western blot 法检测 SMMC-7721、HepG2 细胞中 MMP2、MMP9 及 E-cadherin的表达情况。然后,我们继续上述实验分组,提取总RNA后,RT-PCR法检测两种肝癌细胞中MMP2、MMP9及E-cadherin的mRNA表达情况。结果1.五种肝癌细胞系均可表达COX-2蛋白,其中SMMC-7721、HepG2的表达水平最高。ELISA结果表明,COX-2选择性抑制剂Mel可以显著降低COX-2的代谢产物PGE2的在细胞外的蛋白水平,且随着Mel浓度增加,其抑制PGE2的作用逐渐增强(P<0.05)。2.CCK-8法检测发现,Mel可显著降低肝癌细胞的活力。且在相同时间点,随着Mel浓度增加,肝癌细胞活力逐渐降低。而当Mel浓度相同时(即为20 μM,40 μM或80 μM),我们发现随着处理时间增加,Mel抑制肝癌细胞活力的作用逐渐增强,Mel抑制肝癌细胞活力具有时间以及浓度依赖性的特点。3.细胞周期检测发现Mel具有细胞周期阻滞作用,其可将细胞分裂周期停止在G1期(P<0.01),而进入S期或者M期的细胞数量显著下降。进一步Western blot法检测发现Mel可显著上调具有周期蛋白依赖激酶抑制作用的p21及p27蛋白的表达水平(P<0.01)。4.Transwell检测发现PGE2可明显增强肝癌细胞SMMC-7721、HepG2的迁移能力(p<0.01),而Mel则可明显抑制上述肝癌细胞的迁移能力(P<0.01),同时Mel可在一定程度上逆转PGE2的促肝癌细胞迁移作用。而Western blot法发现Mel可显著降低COX-2蛋白的表达,且抑制作用具有浓度依赖性(P<0.01)。而进一步Transwell法发现COX-2的siRNA在抑制肝癌细胞中COX-2蛋白表达后,肝癌细胞的迁移能力明显下降(P<0.01)。5.Western blot发现外源性的PGE2可上调SMMC-7721、HepG2中基质金属蛋白酶MMP2与MMP9的蛋白表达水平,同时EMT中关键蛋白E-cadherin的蛋白表达水平则被明显下调(P<0.01)。相反的,Mel则下调了 MMP2与MMP9的蛋白表达水平,而上调了 E-cadherin的蛋白表达水平(P<0.01)。RT-PCR进一步发现在mRNA水平,PGE2与Mel具有与蛋白水平一致的调控作用(P<0.01)。而PGE2与Mel联合应用在可在一定程度上逆转二者单独应用时的调控作用。6.β-catenin的细胞核内及p-GSK-3β的细胞浆内蛋白表达水平经Western blot法检测发现,PGE2可显著增加二者的表达水平,而Mel则明显降低二者蛋白表达水平。加入外源性的PGE2则在一定程度上逆转了 Mel对于β-catenin核内转移及GSK-3β磷酸化的抑制作用。当用特异性的siRNA阻断肝癌细胞内β-catenin的表达时,Western blot显示PGE2对于MMP2与MMP9的蛋白上调作用及对E-cadherin的下调作用被明显抑制,同时Mel对于MMP2与MMP9的下调作用及对E-cadherin的上调作用也被明显逆转。7.在HepG2、SMMC-7721肝癌细胞系中,Transwell发现β-catenin的特异性抑制剂FH535可显著PGE2可显著降低细胞的迁移能力(P<0.05)。而当PGE2联合FH535时,PGE2促进肝癌的迁移能力也被明显逆转。Western blot发现FH535具有与PGE2相反的作用效果,其可以下调MMP2、MMP9蛋白的表达水平,上调E-cadherin蛋白的表达水平(P<0.01),而且FH535可在一定程度上逆转PGE2对于MMP2、MMP9、E-cadherin表达调控作用。RT-PCR结果表明FH535及PGE2对MMP2、MMP9、E-cadherin的mRNA水平的调控作用与在蛋白水平的调控作用一致(P<0.01)。结论1.COX-2可在肝癌细胞系内表达,Meloxicam可显著抑制COX-2的合成及其代谢产物PGE2在肝癌细胞外的水平。2.Meloxicam可通过抑制肝癌细胞的活力及阻滞细胞周期进行,发挥其抗肝癌细胞增殖与迁移的作用。3.COX-2/PGE2通路参与介导Meloxicam抑制肝癌细胞迁移的活性。4.Meloxicam通过PGE2调控基质金属蛋白酶MMP2、MMP9及EMT关键蛋白E-cadherin的表达,发挥其抑制肝癌细胞迁移的作用。5.β-catenin信号通路参与COX-2/PGE2信号的细胞内转导及下游靶蛋白的调控,进而介导Meloxicam的抗肝癌细胞迁移活性。意义1.证实COX-2/PGE2在肝癌细胞侵袭转移中的重要作用,为以此为靶点的研究提供更充实的实验理论依据。2.发现EMT参与Meloxicam调控的肝癌细胞迁移过程。3.β-catenin信号通路介导COX-2/PGE2信号的转导,可为未来肿瘤治疗中靶点的选择提供研究依据。4.为Meloxicam在临床抗肿瘤治疗中应用及类似药物的研究提供实验理论依据。