【摘 要】
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目的:确定CoCl2药物模拟低氧的最适宜的浓度及作用时间,检测适宜浓度及作用时间条件下低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）在宫颈癌组织中的表达情况;探讨不同氧条件下p16基因沉默后,肿瘤细胞的迁移、侵袭、增殖、克隆能力及细胞周期和细胞凋亡的变化情况。方法:1.通过CoCl2试剂建立细胞体外缺氧模型;2.体外培养人宫颈癌HeLa细胞,用不同浓度的CoC
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目的:确定CoCl2药物模拟低氧的最适宜的浓度及作用时间,检测适宜浓度及作用时间条件下低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）在宫颈癌组织中的表达情况;探讨不同氧条件下p16基因沉默后,肿瘤细胞的迁移、侵袭、增殖、克隆能力及细胞周期和细胞凋亡的变化情况。方法:1.通过CoCl2试剂建立细胞体外缺氧模型;2.体外培养人宫颈癌HeLa细胞,用不同浓度的CoCl2（0、50、100、200、400、800μmol/L）作用于人宫颈癌Hela细胞不同时间（6、12、24、48、72小时）后,应用细胞计数试剂（Cell Counting Kit-8,CCK8）法检测不同浓度、不同时间作用下缺氧对人宫颈癌HeLa细胞增殖活力的影响,确定药物的适宜浓度及作用时间;通过免疫蛋白印迹法（Western Blot）方法研究HIF-1α蛋白在宫颈癌HeLa细胞中的表达;3.利用si RNA技术在宫颈癌HeLa细胞中诱导p16基因沉默,以便后续实验;4.运用细胞划痕修复实验（Wound Healing assay）、细胞迁移实验（Transwell assay）、CCK8方法及克隆形成实验（Colony Formation）检测不同氧条件下p16基因沉默后宫颈癌HeLa细胞的迁徙、侵袭、增殖及克隆能力的变化情况;运用PI（FITC Annexinv-PI）方法检测不同氧条件下p16基因沉默后宫颈癌HeLa细胞周期分布及细胞凋亡率的变化。结果:1.宫颈癌HeLa细胞的增殖在不同浓度CoCl2药物中大多受到抑制,当CoCl2浓度增加时,细胞增殖活力呈现下降趋势,且细胞活力下降呈时间和剂量的依赖性,同一CoCl2浓度作用下,随着缺氧时间的增加细胞增殖活力先逐渐提升后慢慢下降,相对于对照组,CoCl2处理HeLa细胞后细胞活力下降呈时间和剂量的依赖性,综合时间和剂量考虑400 u M CoCl2处理24h后产生较大差异。2.免疫蛋白印迹法结果显示,与对照组相比,在宫颈癌HeLa细胞中HIF-1α蛋白表达上调。3.不同氧条件下,p16基因沉默后,常氧与低氧组比较两组间具有统计学意义（P＜0.05）,由此总结,低氧条件下p16基因沉默后相对于常氧条件下宫颈癌HeLa细胞的迁移率提高。4.不同氧条件下,p16基因沉默后,常氧与低氧组比较两组间具有统计学意义（P＜0.05）,由此总结,低氧条件下p16基因沉默后相对于常氧条件下宫颈癌HeLa细胞的细胞侵袭能力显著性提高。5.不同氧条件下,p16基因沉默后,常氧与低氧组比较两组间具有统计学意义（P＜0.05）,由此总结,低氧条件下p16基因沉默后相对于常氧条件下宫颈癌HeLa细胞的细胞增殖率提高。6.不同氧条件下,p16基因沉默后,常氧与低氧组比较两组间具有统计学意义（P＜0.05）,由此总结,低氧条件下p16基因沉默后相对于常氧条件下,宫颈癌HeLa细胞的相对克隆形成率提高。7.不同氧条件下,p16基因沉默后,常氧与低氧组比较两组间具有统计学意义（P＜0.05）,由此总结,低氧条件下p16基因沉默后相对于常氧条件下,宫颈癌HeLa细胞的细胞增殖指数跟S期细胞比率均提高。8.不同氧条件下,p16基因沉默后,常氧与低氧组比较两组间具有统计学意义（P＜0.05）,由此总结,低氧条件下p16基因沉默后相对于常氧条件下,宫颈癌HeLa细胞的细胞凋亡率下降。结论:1.宫颈癌HeLa细胞的增殖活力受缺氧抑制,当CoCl2浓度为400μmol/L、处理24小时后产生较大差异;2.24小时、400 u M CoCl2浓度下,HIF-1α蛋白在宫颈癌HeLa细胞中的表达量高;3.常氧条件下sip16被转染到HeLa细胞中以耗尽其表达后宫颈癌细胞的迁移率、侵袭能力、增殖率、相对克隆形成率均下降,导致细胞周期细胞增殖指数跟S期细胞比率均降低,并诱导其凋亡;4.低氧条件下,sip16被转染到宫颈癌HeLa细胞中以耗尽其表达后迁移率、侵袭能力、增殖率、相对克隆形成率均提高且细胞周期中细胞增殖指数跟S期细胞比率均提高,凋亡率呈下降的趋势。因此,改善肿瘤细胞内的低氧微环境及p16基因的治疗靶向可能是一种有前途的宫颈癌治疗策略。
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