【摘 要】
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神经元之间的信息传递依赖于突触囊泡分泌。装载神经递质的突触囊泡经过转运（trafficking）、拴系（tethering）、锚定（docking）和成熟（priming）过程,与突触前膜不断靠近,在Ca2+触发下与突触前膜发生快速融合（fusion）。SNAREs是介导膜融合的核心蛋白,包括突触前膜上的Syntaxin-1和SNAP-25,突触囊泡上的Synaptobrevin 2。三种SNAR
【基金项目】
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国家自然科学基金； 国家重点基础研究项目； 华中科技大学基金；
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神经元之间的信息传递依赖于突触囊泡分泌。装载神经递质的突触囊泡经过转运（trafficking）、拴系（tethering）、锚定（docking）和成熟（priming）过程,与突触前膜不断靠近,在Ca2+触发下与突触前膜发生快速融合（fusion）。SNAREs是介导膜融合的核心蛋白,包括突触前膜上的Syntaxin-1和SNAP-25,突触囊泡上的Synaptobrevin 2。三种SNARE蛋白组装形成四股螺旋的SNARE复合物,将突触囊泡与突触前膜不断拉近,最终介导膜融合发生。SNARE复合物的正确组装还涉及许多调控蛋白参与,其中Munc18-1和Munc13-1调控SNARE复合物组装过程受到越来越多的关注。Munc18-1与Syntaxin-1紧密结合,将其锁定在闭合状态,使Syntaxin-1无法参与SNARE复合物组装。Munc13-1促进Munc18-1/Syntaxin-1在Synaptobrevin2和SNAP-25存在条件下向SNARE复合物转化;在转化过程中Munc18-1/Syntaxin-1存在两种构象变化,包括Syntaxin-1铰链区构象打开和Munc18-1结构域3a构象伸展。同时Munc18-1结构域3a在SNARE复合物组装过程中起模板作用,促进囊泡的成熟过程。但是在此过程中Munc18-1与Munc13-1之间的联系及介导SNARE复合物组装及囊泡分泌的具体作用机制还不清楚。本课题通过体外与体内实验相结合,进一步研究了Munc18-1和Munc13-1共同调控SNARE复合物组装的过程,阐述了Munc18-1结构域3a与Munc13-1的相互作用对Munc18-1/Syntaxin-1中两种构象变化的调控作用,及Munc18-1结构域3a发挥模板功能的机制。具体研究内容及主要结论如下:（1）通过对Munc18-1结构域3a上的氨基酸进行定点突变,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验筛选获得一系列氨基酸（Q301/K308、K332/K333和L348）,对Munc13-1 MUN结构域催化Munc18-1/Syntaxin-1向SNARE复合物转化有重要作用。（2）通过全细胞膜片钳技术,发现这些氨基酸突变后严重破坏突触囊泡分泌的自发释放、动作电位触发的同步释放以及可释放囊泡库大小;通过激光共聚焦显微成像发现这些突变并不影响Syntaxin-1转运到细胞质膜上,说明结构域3a上的突变通过破坏突触囊泡的成熟过程来抑制囊泡分泌,而突触囊泡的锚定过程不受影响。（3）通过单分子荧光共振能量转移、GST pull-down及群体荧光共振能量转移实验发现,氨基酸残基Q301/K308介导Munc18-1/Syntaxin-1与MUN结构域相互作用,这种相互作用使MUN结构域催化打开Syntaxin-1铰链区,Syntaxin-1铰链区打开导致结构域3a构象伸展,从而促进结构域3a与Synaptobrevin 2结合,L348是介导结构域3a与Synaptobrevin 2相互作用的关键氨基酸。但是结构域3a伸展不能导致Syntaxin-1铰链区打开。（4）通过X-射线晶体学实验,获得了Munc18-1突变体K332E/K333E分辨率为3.4?的晶体结构;通过结构比对揭示了Munc18-1的结构可变性,这种结构可变性允许Munc18-1与不同构象的Syntaxin-1结合。通过分子排阻层析,发现K332/K333氨基酸残基介导Munc18-1与Syntaxin-1的SNARE基序（H3结构域）相互作用。这些相互作用使Munc18-1能同时结合Syntaxin-1的H3结构域和Synaptobrevin 2,从而发挥模板功能促进SNARE复合物组装。总而言之,本论文揭示了Munc18-1结构域3a如何在Munc13-1的调控下使Munc18-1/Syntaxin-1复合物被激活,进一步发挥模板作用促进SNARE复合物组装的分子机制。
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