论文部分内容阅读
背景脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种中枢神经系统的严重创伤。由于交通意外、高处坠落等原因导致的SCI正逐年上升。SCI多见于青壮年,不仅可危及生命,也常导致患者感觉、运动、反射与括约肌功能障碍,特别是颈髓的损伤,甚至遗留永久性的残疾,大多数SCI患者需要长期住院治疗和康复,给家庭和社会带来了沉重的负担。因此,如何促进SCI后修复损伤的神经是目前世界各国研究的热点和难点。脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤,其中以继发性损伤更为严重,继发性损伤病理改变包括细胞的炎症和坏死、细胞因子的释放、生化功能紊乱、肿瘤坏死因子(TNF-α)、氧自由基(ROS)和金属蛋白酶(MMPs)的生成、血管通透性的增大、血脑屏障破坏等导致神经元的损伤,同时内皮细胞黏附分子表达上调并参与了免疫细胞在受损脊髓的聚集和浸润。近年来研究表明,SCI引起的细胞内质网中错误折叠、未折叠蛋白聚集以及Ca2+平衡紊乱可致内质网功能受损并引发内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。当严重的或长时间的ERS损伤内质网的功能时,引起神经元产生强烈的ERS反应,诱导CHOP/GADD153表达,引起神经元的凋亡,导致神经功能的障碍。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在脊髓损伤中的治疗作用已经被广泛报道。它的保护作用包括:释放外泌体、脑源性生长因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养因子(NT-3、NT-4/5)、神经生长因子(NGF)等;调控巨噬细胞,降低炎症因子的表达从而改善微环境;调节蛋白酶的激活,保护神经;促进血管内皮生长因子合成,刺激新血管的形成;减少内质网氧化应激;刺激髓鞘再生成;抑制胶质瘢痕等。BMSCs含有丰富的线粒体,线粒体作为细胞产生能量的细胞器,也是细胞进行有氧呼吸的主要场所。近期的研究表明,BMSCs可以输送线粒体给损伤细胞,增加细胞的ATP含量,减少氧化应激损伤等发挥保护作用。综上,本研究提出假说:BMSCs来源的线粒体能转移给受损的神经元,并可能通过减轻ERS损伤发挥保护作用,促进脊髓损伤后运动功能的恢复。目的探讨BMSCs来源的线粒体是否能转移给SCI后的受损神经元,通过减轻ERS损伤,促进运动功能恢复,并初步探讨其可能保护机制,以期为临床治疗提供新的思路。方法(1)体内实验部分:建立SD大鼠打击损伤模型,实验动物共分三组:正常组(Sham),脊髓损伤组+溶剂对照组(SCI+Vehicle),脊髓损伤组+线粒体注射组(SCI+Mito),每组11只。在脊髓损伤48 h后,灌流固定,取损伤位置脊髓,冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察MitoTracker Red荧光标记的线粒体进入脊髓神经元的情况;TUNEL染色检测脊髓切片细胞的凋亡数目。在脊髓损伤6周后,H&E染色观察脊髓损伤处空洞形成情况;免疫组化检测神经丝蛋白(Neurofilament-H)NF的表达情况;western blot检测生长相关蛋白(Growth associated protein-43,GAP43)的表达;BBB评分评估损伤后运动功能恢复情况。(2)体外实验部分:培养大鼠脊髓前角运动神经元VSC4.1运动神经细胞系。建立氧糖剥夺(OGD)模型,一共分三组:正常组(Control),OGD+溶剂对照组(OGD+Vehicle组),OGD+线粒体组(OGD+Mito)。将VSC4.1运动神经元与BMSCs进行直接共培养或Transwell间接共培养,观察线粒体的转移情况;BMSCs在高糖无血清培养基中培养24 h后,收集上清液获得BMSCs条件培养基,透射电镜检测条件培养基中的线粒体;ATP试剂盒检测VSC4.1运动神经元的ATP含量;LDH试剂盒检测VSC4.1运动神经元损伤情况;AnnexinV-PI流式检测VSC4.1运动神经元的凋亡率;Western blot检测VSC4.1运动神经元的ERS凋亡蛋白CHOP的表达情况。结果(1)建立大鼠打击损伤模型;激光共聚焦显微镜观察证实红色荧光MitoTracker Red标记的线粒体被脊髓损伤处神经元摄取,进入神经元胞体内;TUNEL染色显示,与SCI+Vehicle组相比,SCI+Mito组细胞凋亡数目显著降低(25.67±5.51 vs 52±6.08);H&E染色显示SCI+Mito组脊髓空洞面积显著少于SCI+Vehicle 组(0.88±0.01 fold of SCI+Vehicle group);同时免疫组化染色显示SCI+Mito 组 NF阳性面积显著大于 SCI+Vehicle 组(1.52±0.05 fold of SCI+Vehicle);Western blot结果显示SCI+Mito组GAP43蛋白的表达显著多于SCI+Vehicle 组(0.75±0.09 fold of Sham vs 0.50±0.07 fold of Sham);在脊髓损伤后第6周,SCI+Mito组大鼠的BBB评分显著高于SCI+Vehicle组(9.8±0.80 vs 5.5±0.50)。(2)建立VSC4.1运动神经元OGD模型;激光共聚焦显微镜观察证实:直接共培养条件下,线粒体通过隧道纳米管(Tunnel nanotube,TNTs),从BMSCs转移到受损的神经元;在Transwell间接共培养条件,线粒体通过BMSCs旁分泌途径释放,被受损的神经元摄取转移到胞内;同时,透射电镜观察证实了 BMSCs的培养基中有释放的单个、完整的线粒体。分离BMSCs来源的线粒体,加入到OGD受损的神经元培养基中,30 min后所有受损的神经元胞体中都出现红色荧光MitoTracker Red标记的线粒体。与OGD+Vehicle组相比,OGD+Mito组神经元的LDH的释放显著降低(63.40±0.05 fold of OGD+Vehicle),并且ATP含量显著增加(1.48±0.01 nmol/mg vs 1.13±0.06 nmol/mg),神经元的凋亡率显著降低(1.49±0.09 vs 2.50±0.17);ERS 凋亡蛋白 CHOP 表达显著减少(3.80±0.65 fold of control vs 9.31±1.72 fold of control)。结论BMSCs来源的线粒体可通过细胞间形成的TNTs直接转移至受损神经元,也可以通过旁分泌释放途径间接转移给受损神经元;进入损伤神经元的线粒体增加了细胞的ATP含量,降低凋亡蛋白CHOP表达,减轻ERS诱导的凋亡和损伤;在体内,线粒体移植可以减少SCI后细胞凋亡,减小脊髓空洞,增加GAP43和NF的表达,促进大鼠SCI后运动功能的恢复。