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研究目的研究枸杞咀嚼片的免疫调节功能及其抗氧化效应,并尝试从抗氧化途径阐释枸杞咀嚼片的免疫调节功能的机制。研究背景枸杞（Lycium chinese）系管状花目（Tubiflorae）茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）多年生落叶灌木,多分布于黄土高原,可在低温、干旱区环境下生长,果实被称为枸蹄子、枸杞豆、红耳坠等,是传统的药食同源植物资源。枸杞鲜果为深红色,外形呈长圆或卵形,籽粒少,果肉多汁甘甜,多采用阳光暴晒、风干或烘烤等方式加工制成枸杞子。宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）是对分布在中国西北地区枸杞品种的统称,被新中国药典所收载。枸杞鲜果各营养成分含量均比干果高,但由于皮薄,存在运输中易受伤害,保鲜、保质期短等问题。课题组前期根据枸杞鲜果的加工开发特点,改善其加工工艺,以枸杞鲜果匀浆为原料研发制备成枸杞咀嚼片,现对其进行机体免疫功能调节和抗氧化活性的研究。研究内容小鼠经口给予枸杞咀嚼片4周,观察枸杞咀嚼片对机体免疫功能的调节作用。通过检测给药后小鼠血清中抗氧化酶和丙二醛含量以及体外自由基评价体系的自由基清除能力,观察枸杞咀嚼片在体内和体外的抗氧化活性。通过建立过氧化氢诱导的巨噬细胞氧化损伤模型,观察药物对细胞吞噬及分泌功能的影响,结合药物对血红素氧合酶Ⅰ（Heme Oxygenase-1,HO-1）mRNA表达的影响,尝试从抗氧化角度阐释枸杞咀嚼片调节免疫功能的机制。枸杞咀嚼片对正常小鼠免疫功能的调节160只SPF级Balb/C小鼠,雄性,体重（20±2）g,其中40只用于血清溶血素测定和脏器测定,40只用于小鼠碳廓清实验,32只用于NK细胞活性测定,48只用于小鼠脾淋巴细胞转化实验,脾淋巴细胞增殖实验小鼠获得血清后进行体内抗氧化活性实验。小鼠进行适应性饲养3d后,按体重将各实验小鼠随机分为4个组,包括空白对照组、枸杞咀嚼片低、中、高剂量组,其中枸杞咀嚼片各组的给药剂量分别为0.25,0.5和1.5 g·kg-1·d-1。灌胃量为10 mL·kg-1·d-1,每天1次,连续灌胃28 d,定期称重。抗氧化活性测定测定给药小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量判断枸杞咀嚼片对体内抗氧化能力的影响;并通过对DPPH、ABTS+以及OH-自由基清除能力实验测定枸杞咀嚼片体外抗氧化活性。对过氧化氢诱导Raw264.7巨噬细胞损伤的保护作用以600 μM的H2O2建立Raw264.7细胞氧化损伤模型,给药低、中、高浓度分别为0.03125、0.0625、0.125 g.L-1,观察药物对细胞吞噬及分泌功能的影响,结合药物对血红素氧合酶Ⅰ（Heme Oxygenase-1,HO-1）mRNA表达的影响,尝试从抗氧化角度阐释枸杞咀嚼片调节免疫功能的机制。实验结果枸杞咀嚼片对正常小鼠免疫功能的研究对小鼠巨噬细胞吞噬功能的试验结果显示,空白组小鼠吞噬指数α为2.587±0.940;与空白组比较,枸杞咀嚼片中、高剂量组吞噬指数升高,其中高剂量组可显著升高吞噬指数（P＜0.05）。枸杞咀嚼片三个剂量组均可显著提高小鼠血清溶血素含量（P＜0.01）,其中低剂量组小鼠血清溶血素含量升高最为明显。小鼠免疫器官指数实验发现,枸杞咀嚼片高剂量组脾脏指数和胸腺指数均显著增加（P＜0.01）。小鼠NK细胞活性实验发现,与空白对照组相比,枸杞咀嚼片低、中、高剂量组的NK细胞活性均显著增加（P＜0.05,P＜0.01）。在ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验中,与空白组比较,枸杞咀嚼片低、中、高剂量组均可显著促进ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞转化（P＜0.05,P＜0.01）,其中在低剂量组小鼠脾淋巴细胞转化率最高,可达到47.8%。枸杞咀嚼片抗氧化活性研究小鼠口服枸杞咀嚼片4周,与空白组比较,枸杞咀嚼片中剂量组小鼠血清GSH-Px活性显著升高（P＜0.05）;枸杞咀嚼片高剂量组小鼠血清MDA含量显著降低（P＜0.05）;枸杞咀嚼片3个剂量组对小鼠血清SOD活性未见明显差异。体外抗氧化活性评价实验发现,枸杞咀嚼片以浓度依赖的方式清除DPPH+、ABTS+和羟基自由基,并在质量浓度为44.9 g·L-1时,对ABTS+以及羟基自由基的清除率可达到100%,质量浓度为8.7 g·L-1时对DPPH自由基清除率达到了95.24±0.02%,枸杞咀嚼片清除50%DPPH+、ABTS+和羟基自由基的半数浓度（IC50）分别为 1.637±0.198、2.041±0.025 和10.273±0.035 g·L-1;提示枸杞咀嚼片对三种自由基均具有一定的清除能力,对三种自由基清除能力的排序为DPPH+＞ABTS+＞OH-。枸杞咀嚼片对过氧化氢诱导Raw264.7巨噬细胞损伤的保护作用600 μM H2O2刺激下Raw264.7细胞的吞噬功能降低,HO-1 mRNA表达升高（P＜0.01）,枸杞咀嚼片在浓度为0.0625和0.125 g·L-1时可显著提高Raw264.7巨噬细胞吞噬功能（P＜0.05）;枸杞咀嚼片在浓度为0.0625和0.125 g·L-1时可极显著提高Raw264.7巨噬细胞分泌TNF-α的含量（P＜0.01）;枸杞咀嚼片在浓度为0.0625、0.125 g·L-1时可显著降低由于氧化应激导致的HO-1 mRNA表达量的增加（P＜0.05）。结论1、本研究结果显示,枸杞咀嚼片可显著提高小鼠巨噬细胞吞噬功能,提高NK细胞活性、促进ConA诱导的脾淋巴细胞转化能力,提高小鼠血清溶血素水平和免疫器官指数,提示枸杞咀嚼片具有提高免疫功能的作用。2、通过体内血清抗氧化实验和体外自由基清除实验发现枸杞咀嚼片具有体内和体外抗氧化能力。3、枸杞咀嚼片可以通过抗氧化途径提高Raw264.7巨噬细胞活性,并通过促进TNF-α的分泌、降低氧化应激导致的HO-1 mRNA表达量的增加以提高免疫功能。