论文部分内容阅读
小麦赤霉病是小麦上的重要真菌病害,该病主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起。禾谷镰刀菌为同宗配合子囊菌,有性生殖时期产生的子囊孢子是小麦赤霉病的主要初侵染源。由于生产上缺乏有效的抗病品种,小麦赤霉病多以施用化学农药防治为主。长期施用化学农药导致病菌产生抗药性,β微管蛋白是多菌灵的药剂靶标,已在多种植物病原菌中报道β微管蛋白突变导致抗药性。禾谷镰刀菌中有TUB1和TUB2两个β微管蛋白编码基因,然而目前田间多菌灵抗性菌株中只鉴定到了TUB2的抗药性突变,却没有鉴定到TUB1的抗药性突变。实验室前期研究证明禾谷镰刀菌TUB2主要作用于菌丝生长,而TUB1主要作用于有性生殖。为了进一步探索TUB1在有性生殖中的功能及其与多菌灵抗药性之间的关系,本文对TUB1的功能进行了深入研究。主要研究结果如下:1.研究发现tub1缺失突变体能产生不可育的小型子囊壳,子囊壳发育出了孔口,但是子囊壳内只产生有限的产囊菌丝,不能继续发育成子囊和子囊孢子。tub1突变体做母本与野生型杂交时表现雌性不育,表明TUB1在子囊壳前体发育中具有重要作用。tub1做父本与mat1-1突变体杂交时,可观察到由减数分裂沉默（MSUD）机制诱导的TUB1基因沉默导致的畸形子囊孢子,表明TUB1在子囊孢子发育中具有重要作用。通过重复序列诱导的点突变（RIP）方法鉴定到Tub1蛋白上5个潜在功能重要的位点（T23、G34、V119、V180和D197）。2.基因功能互补实验发现,缺少3’-UTR序列的TUB1基因只能互补tub1缺失突变体的营养生长缺陷,但不能互补其有性生殖缺陷,而包含3’-UTR序列的TUB1基因可同时互补营养生长和有性生殖缺陷。上述结果表明TUB1有性生殖的功能依赖其完整的3’-UTR序列,而营养生长的功能不受3’-UTR调控。RNA-seq转录组测序分析证明相比于营养生长阶段,禾谷镰刀菌有性生殖阶段的转录本偏好于长3’-UTR。在禾谷镰刀菌中鉴定出7个参与选择性多聚腺苷酸化（APA）的蛋白因子,通过基因敲除获得了其中4个基因（hrp1、fip1、rna15和cdc73）的缺失突变体,另外3个可能为必需基因,敲除致死。生长和有性生殖表型实验发现,hrp1和rna15突变体仅能产生极小的菌落,不能产生子囊壳;fip1突变体生长正常,但子囊孢子不能喷发;cdc73突变体生长下降25%,产生的子囊孢子为两细胞（野生型为四细胞）。RNA-seq转录组测序分析证明fip1、hrp1和rna15突变体与野生型相比偏好于长3’-UTR转录本,表型越严重的突变体越偏好于长3’-UTR转录本。但是并没有发现TUB1转录本的3’-UTR长度在野生型营养生长和有性生殖阶段,以及hrp1、fip1和rna15敲除突变体中发生改变。上述研究结果表明禾谷镰刀菌有性生殖受到选择性APA的调控,但TUB1 3’-UTR在有性生殖中的特异功能独立于APA调控。3.在TUB1转录本中鉴定到3个A-to-I RNA编辑位点,均可导致氨基酸发生改变（N347D、T362A和I368V）。为了证明A-to-I RNA编辑对TUB1基因的调控作用,将TUB1的每个编辑位点分别突变为非编辑形式和编辑后形式。研究结果表明,TUB1三个编辑位点突变为非编辑形式后均可以互补tub1缺失突变体的表型。尽管TUB1第362或368位编辑位点突变为编辑后形式（T362D或I368V）后可以互补tub1缺失突变体的表型,但第347位编辑位点突变为编辑后形式（N347D）后不能完全互补tub1缺失突变体的表型,表明第347位A-to-I RNA编辑负调控TUB1基因的功能。4.将已报道的TUB2基因上的抗药性突变引入到TUB1的同源位置上,研究发现TUB1中引入F167Y抗药性突变可显著提高突变菌株对多菌灵的抗药性,表明TUB1突变可引起菌株抗药性产生。进一步研究发现TUB1 F167Y突变菌株有性生殖缺陷,子囊孢子畸形。因此,田间抗药菌株中鉴定不到TUB1突变的可能原因是TUB1抗药突变影响禾谷镰刀菌的有性生殖。综上所述,本研究证明TUB1基因在禾谷镰刀菌子囊壳前体和子囊孢子发育中均发挥重要功能,其有性生殖功能受到3’-UTR和A-to-I RNA编辑的调控。TUB1在禾谷镰刀菌对多菌灵抗性中发挥作用,但很可能由于TUB1抗药性突变引起有性生殖缺陷,导致田间抗药菌株中鉴定不到TUB1上发生的突变。