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氰水解酶和氰水合酶属于腈超家族酶,二者均能有效水解氰化氢,但是产物不同(前者为甲酸和氨,后者为甲酰胺),目前已发现的两种酶均来源不同菌株。本课题组在前期研究中从菌株Alcaligenes sp. DN25中克隆并纯化出—氰降解酶(命名为cdE),水解产物中同时包含甲酸、氨和甲酰胺。本论文因此对cdE所表现出来的双功能催化作用进行探讨。首先,采用梯度洗脱纯化的方法获得了纯度为97%的cdE,确定其水解反应最佳pH和温度分别为7和30℃,纯酶水解氰化钾的两种产物(甲酸和甲酰胺)的相对含量会受到pH和温度的影响。无组氨酸标签cdE水解实验结果证明了组氨酸标签对cdE的催化特性无影响。由此认为cdE既具有氰水解酶的功能也有氰水合酶的功能。cdE氨基酸序列与源自Pseudomonas stutzeri AK61的氰水解酶的相似度为99%,经突变实验对比分析,认为两者催化功能的差异不是由于基因突变引起的。提出cdE的催化机理为：底物与催化三联体Cys163-Glu47-Lys129形成的中间体可同时以途径A(表现为氰水解酶功能)和途径B(表现为氰水合酶功能)完成水解反应,且途径A和途径B在氰水解过程中具有选择性。进一步以同源建模和分子对接技术为手段,通过定点突变手段筛选到几个对cdE的催化功能起到重要作用的突变体。这些突变体中除了Trp164A1a、 Met162His和Glu136Ala利于甲酰胺的生成,三个突变体水解产物中甲酰胺和甲酸之比分别是cdE的5.5倍、1.24倍和1.76倍,其余突变体(Met162Ala,Met162Cys, Met162Ser, Met162Glu, Met162Asn, Met162Phe, His166Asn, Ser101Ala)均利于甲酸的生成,突变体水解产物中甲酸和甲酰胺之比分别是cdE的2.9倍、2.8倍、7.8倍、3.2倍、1.8倍、1.3倍、1.7倍和2.8倍；组合突变体(Met162Ala/Ser101Ala,Met162Cys/Ser101Ala)具有一定的组合效果,其水解产物中甲酸和甲酰胺之比分别是cdE的4.9倍和5.1倍。碳端缺失突变体△310和A307的水解产物中甲酸和甲酰胺之比分别是cdE的1.27倍和1.35倍。用Alcaligenes sp. DN25处理某选矿厂含氰废水,对总氰的降解率可达100%(反应23h后)；选矿矿渣浸出液总氰浓度为8.8mg/L时,Alcaligenes sp. DN25对总氰的去除效率可达95%,总氰浓度为5-20mg/L且同时外加碳源氮源时,菌株生长和自身解毒过程同时进行,培养至67h,游离氰去除率达87%以上。