【摘 要】
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根据已知的HWTX-IV的一级结构和酵母的偏爱密码子,人工合成了4条寡聚核苷酸链,经磷酸化、退火连接得到完整的HWTX-IV基因.HWTX-IV基因被克隆进表达载体pPIC9K,重组载体被命名
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根据已知的HWTX-IV的一级结构和酵母的偏爱密码子,人工合成了4条寡聚核苷酸链,经磷酸化、退火连接得到完整的HWTX-IV基因.HWTX-IV基因被克隆进表达载体pPIC9K,重组载体被命名为pPIC9K/HWTX-IV.pPIC9K/HWTX-IV由BglⅡ线性化后被导入宿主菌GS115,整合HWTX-IV基因的宿主菌经0.5%甲醇诱导表达72h后,16.5%Trcine SDS-PAGE鉴定,表达HWTX-IV的重组菌株被命名为HWTX-IV/GS115.重组菌株扩大培养,发酵上清经硫酸铵沉淀、CM阳离子交换柱层析、C18反相柱层析分离纯化,MALDI-TOF鉴定,表明HWTX-IV被正确表达,表达产物为N-端多4个氨基酸残基(FEVY)的HWTX-IV,且有严重的C-端不均一现象.不均一的混合物理化性质接近,因而未能得到均一的rHWTX-IV进行生理活性分析.以重组载体pVT102U/HWTX-XI为模板,采用PCR定点突变的重叠延伸法获得突变基因,克隆到pVT102U中,六种突变体均在酿酒酵母S-78中被分泌表达,表达量从4.2-34.5mg/L不等.胰蛋白酶抑制活性表明突变体的活性与天然毒素都有差异,其中K14A活性下降了3107.5倍,说明K14是HWTX-XI胰蛋白酶抑制活性的关键残基.
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