论文部分内容阅读
水杨酸(Salicylic acid,SA)是一种调控植物生长发育的重要植物酚类激素,精确地调控植物体内SA的合成代谢和分解代谢对于维持SA的动态平衡具有重要意义。我们前期实验证明SA羟基化是SA的重要修饰方式,通过清除植物体内过多的SA来调控SA动态平衡,其中S5H受SA诱导,将SA羟基化生成2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHBA),但是对于SA羟基化酶基因S5H的转录调控机理尚不清楚。本研究以SA羟基化酶基因S5H为突破口,利用酵母单杂交技术,筛选与S5H启动子互作的转录因子,利用遗传学、植物生理学、植物代谢、形态学等方法研究其表达调控模式和生物学功能,从而解析S5H基因的转录调控网络,主要研究结果如下:(1)鉴定了598 bp的S5H启动子区域具有完整的启动子功能由于全长S5H启动子作为“诱饵”进行AbA抗性筛选时,其在酵母单杂交系统中存在自激活现象,因此我们将启动子截短为598 bp、1232 bp、1843 bp三个不同长度片段,以GUS作为报告基因构建双元表达载体,用于筛选具有功能的较短的启动子片段。烟草瞬时表达和稳定转基因株系的GUS染色结果表明,这三段启动子片段均具有启动子活性且具有SA诱导活性,因此我们利用598 bp S5H启动子作为诱饵用于酵母单杂交筛选调控S5H基因表达的转录因子。(2)通过酵母单杂交筛选验证获得了6个与S5H启动子结合的转录因子选用衰老叶片和病原菌Pst DC3000处理的叶片提取RNA,建立cDNA文库,利用酵母单杂交系统筛选调控S5H表达的转录因子。通过对阳性克隆PCR产物检测,经测序和NCBI数据库Blast比对分析,获得15个转录因子作为候选互作蛋白。结合酵母单杂交系统与DLR分析系统验证结果确认转录因子WRKY1、AXR2、PH、C2H2、HMG和WRKY18与598 bp的S5H启动子存在潜在的结合关系。(3)基因缺失和过表达实验表明WRKY1调控叶片衰老表型通过分子鉴定获得了互作蛋白的T-DNA插入纯合突变体,对其进行叶片离体黑暗诱导处理。发现与野生型相比,wrky18,axr2突变体叶片具有提前衰老的表型,wrky1,nac6突变体叶片出现晚衰表型。结合酵母单杂交系统与DLR分析系统结果,我们选取了WRKY1作为目标基因进行深入研究,通过构建WRKY1过表达株系,发现过表达株系出现叶片早衰表型,进一步说明WRKY1基因与叶片衰老密切相关。(4)WRKY1超表达和wrky1突变体中水杨酸代谢相关基因的表达特征在WRKY1-OE中,S5H,S3H基因的表达显著上升,同时水杨酸合成基因ICS1,ICS2的表达明显上调,另外,SAG13,PR1,SGR1在过表达植物中基因显著上调,与其叶片早衰表型一致,而在wrky1中被抑制表达,与其叶片衰老延缓表型相一致。(5)WRKY1超表达和wrky1突变体中水杨酸的代谢分析通过对WRKY1超表达和突变体植株中自由态SA,总SA以及总2,5-DHBA的测定结果显示,与野生型相比,超表达株系中三种成分均有所上升,而突变体wrky1中的总SA以及2,5-DHBA含量显著下调。因此我们推测可能由于WRKY1协调诱导ICS1,ICS2以及S5H的表达从而增加了SA和2,5-DHBA的合成,诱导了叶片早衰进程。综上所述,本研究证明598 bp的S5H启动子区域具有完整的启动子功能,并利用其作为诱饵片段筛选S5H基因的调节因子。验证获得了6个与S5H启动子结合的转录因子,进一步鉴定获得了一个能够调控SA和2,5-DHBA代谢以及叶片衰老的转录因子WRKY1。