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一、背景与目的肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)高居我国恶性肿瘤病死率第二位,而乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的慢性感染及其相关性肝病是导致HCC高发生率的最主要病因之一。HBV相关性肝癌的病理分期、侵袭转移能力均强于非HBV相关性肝癌,且起病隐匿,进展迅速。截至目前,HBV相关性肝癌的早期检出率、5年生存率仍然很低。HBV相关性肝癌进展较快、预后较差的主要原因是肝内、肝外转移以及肿瘤组织对大血管的浸润。目前,人们对HBV促进肝癌发生、发展乃至转移的具体机制仍不清楚。多数研究认为,HBV基因组中X基因编码的HBx蛋白在肝癌的发生中起主要作用,但对HBx诱导肝细胞癌变、影响肝细胞生长、分化、迁移能力的原因还缺乏认识。随着非编码RNA在调控基因表达中作用的发现,越来越多的研究认为癌基因、抑癌基因的功能异常是由于非编码RNA的异常调控所致。非编码RNA在肝癌发生发展中所起的作用正逐渐被揭示,也逐渐受到研究者的重视。作为功能性非编码RNA的一种,长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)被证实在肝癌的发生发展中调控众多基因的表达,影响肝癌的进展。但是,有关lncRNA在HBV相关性肝癌中的作用及调控方式仍不清楚。为了探索lncRNA在HBV相关性肝癌发生发展过程中的作用,我们选定了一个新发现的与肝癌侵袭、转移密切相关的lncRNA-ATB,探讨致病蛋白HBx与lncRNA-ATB表达之间的关系。在此基础上,进一步探索HBx与lncRNA-ATB之间的上下游关系及可能的调控机制,明确lncRNA-ATB与HBx(+)肝癌细胞侵袭、迁移能力之间的关系,以期探究HBx是否可以通过调控lncRNA-ATB的表达促进肝癌的侵袭、转移,为提高HBV相关性肝癌的早期诊断率提供理论基础。二、方法第一部分:HBx对肝癌细胞中lncRNA-ATB水平的影响及机制研究利用慢病毒构建稳定表达HBx的肝癌细胞株HBx-HepG2,对比HBx-HepG2与HepG2中lncRNA-ATB含量的变化。检测两种细胞中的自噬水平及TGF-β含量,诱导自噬后观察lncRNA-ATB及TGF-β水平的变化,明确自噬、TGF-β、lncRNA-ATB之间的相关性。再通过敲除TGF-β观察自噬的变化,明确HBx-HepG2中自噬、TGF-β、lncRNA-ATB之间的上下游关系。第二部分:lncRNA-ATB对HBx(+)肝癌细胞迁移能力的影响收集临床肝癌标本,检测组织中lncRNA-ATB水平是否与HBV感染情况、肝癌恶性程度有关;比较HBx(+)肝癌细胞和HBx(-)肝癌细胞的侵袭、迁移能力,论证HBx是否能影响肝癌细胞的侵袭、迁移。结合第一部分内容,进一步比较敲除TGF-β、lncRNA-ATB前后HBx(+)肝癌细胞迁移、愈合能力的变化,明确HBx是否可以通过上调lncRNA-ATB的表达,促进肝癌细胞的迁移、愈合。三、结果第一部分:慢病毒转染HBx后HepG2细胞可以稳定表达HBx,且HBx-HepG2内lncRNA-ATB、TGF-β的水平均高于HepG2细胞。转染HBx后,HepG2细胞的自噬水平显著升高,饥饿诱导自噬后lncRNA-ATB及TGF-β的含量进一步升高。敲除TGF-β后lncRNA-ATB的表达、HBx-HepG2细胞的自噬都受到了抑制,但用饥饿刺激诱导自噬后细胞自噬水平、TGF-β及lncRNA-ATB的含量又出现了回升,表明HBx-HepG2中自噬位于TGF-β的上游。第二部分:,临床统计分析显示,肝癌组织中lncRNA-ATB水平与HBV的感染情况显著相关,HBV(+)肝癌组织中lncRNA-ATB含量高于HBV(-)组织。此外,高表达lncRNA-ATB还与较晚的TNM分期相关。细胞功能实验证实,HBx(+)肝癌细胞侵袭、迁移能力更强,而敲除TGF-β或lncRNA-ATB均能降低HBx(+)肝癌细胞的迁移、愈合能力。四、结论1.高表达HBx的肝癌组织中存在lncRNA-ATB水平的升高;2.高表达lncRNA-ATB的肝癌患者具有较差的肿瘤分期;3.HBx通过促进肝癌细胞的自噬,上调了 TGF-β的水平,进而促进了 lncRNA-ATB的表达;4.由上述机制导致的lncRNA-ATB高表达促进了肝癌细胞的迁移及愈合。