第一部分:目的:了解颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)及其降解体在主动脉瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)表型转换和成骨分化中的作用,为钙化性主动脉瓣膜疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)的临床早期干预和治疗提供理论基础。方法:取非钙化主动脉瓣组织(3例)和CAVD主动脉瓣组织(6例),通过免疫组织化学染色及Western blot检测颗粒蛋白前体PGRN及其降解体、肌纤维样表型转变标志物α-SMA、collage I,早期成骨指标Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2),晚期成骨指标骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达;Western blot检测促炎因子TNF-α及凋亡指标C Caspase3、Bax;采用I型胶原酶连续消化法分离人和猪的VICs,观察细胞形态及生长状态,并采用细胞免疫荧光染色行表型鉴定;采用成骨培养基(osteogenic medium,OM)诱导人VICs钙化,Western blot检测PGRN及其降解体的表达;采用OM或TNF-α诱导猪VICs构建钙化模型,并加入人PGRN重组蛋白或转染腺病毒Ad-45GRN分别上调PGRN及其降解体45-GRN水平。qPCR和Western blot检测α-SMA、collage I、Runx2、OPN、OCN的表达;Western blot检测TNF-α及C Caspase3、Bax的表达;细胞免疫荧光染色检测α-SMA的表达;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测早期成骨指标ALP表达的改变;晚期通过茜素红S染色检测钙盐累积。结果:与非钙化瓣膜组织相比,CAVD瓣膜组织中PGRN和其降解体45KD GRN(45-GRN)都增加,但45-GRN的含量和增加的趋势显著高于PGRN;α-SMA、collage I、Runx2、OPN、OCN、TNF-α、C Caspase3及Bax在CAVD组中表达均明显高于正常组。成功分离出原代VICs,α-SMA和Vimentin阳性,vWF阴性。与正常培养组相比,OM诱导的人VICs细胞PGRN明显减少,45-GRN却显著增加。PGRN可降低VICs的ALP活性和钙盐沉积;PGRN可下调α-SMA、成骨相关指标Runx2、OPN、OCN的表达,TNF-α、C Caspase3及Bax的表达水平明显被抑制;但是,45-GRN显著上调TNF-α、C Caspase3及Bax,并促进VICs的肌纤维样表型转变指标和成骨相关指标水平的上升。结论:PGRN可抑制炎症,对VICs的凋亡、表型转换和成骨分化发挥负向调控作用,45-GRN则发挥正向调控作用。第二部分:目的:探讨PGRN及45-GRN影响VICs表型转换和成骨分化的作用机制。方法:采用猪VICs,加入人PGRN重组蛋白和转染腺病毒Ad-45GRN分别上调PGRN和45-GRN水平。Western blot检测PGRN/45-GRN对成骨信号通路中Smad1/5/8、NF-κB和AKT的总蛋白及磷酸化水平的影响;Western blot检测AKT的激活剂SC-79在PGRN抑制VICs表型转换和成骨分化中的作用;最后分别加入Smad1/5/8的抑制剂LDN193189、NF-κB的抑制剂BAY11-7082、以及AKT的抑制剂LY294002进行45-GRN促进VICs表型转换和成骨分化作用的反向验证。结果:PGRN可明显抑制p-AKT的表达,45-GRN可显著上调成骨信号通路中Smad1/5/8、NF-κB和AKT的磷酸化水平。结论:PGRN可明显抑制VICs的表型转换和成骨分化,其作用可能是通过抑制AKT信号通路来实现的。45-GRN可能是通过激活Smad1/5/8、NF-κB和AKT信号通路从而促进VICs的钙化。