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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤。脊髓损伤导致长久的感觉、运动功能及自主神经功能障碍。髓鞘完整是维持CNS的正常生理功能的基础。脊髓损伤同样导致髓鞘结构破坏,暴露轴突,阻断神经信号传导,也是患者瘫痪的重要原因。随着SCI病程的发展,少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)会变性凋亡,损伤病灶髓鞘碎片的存在也会增加神经再生的难度。所以,在SCI恢复过程中,加速髓鞘再生和保持髓鞘完整性至关重要,是治疗脊髓损伤的潜在干预靶点。髓鞘由少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)增殖、分化为的成熟少突胶质细胞形成,所以探索OPCs向OLs转化过程的机制对促进SCI后再髓鞘化至关重要。我们前期研究发现,提高初级运动皮层(primary motor cortex,M1)锥体神经元电活动可以促进OPCs的增殖、分化以及髓鞘化,同时可以改善SCI动物损伤肢体的运动功能。但是,关于M1区神经元电活动调控OPCs发育的机制目前尚不清楚。有研究发现,AKT/m TOR通路在OLs的发育过程中有着重要的作用。抑制AKT/m TOR的激活会减少新生小鼠白质中的OLs数量以及降低白质髓鞘化水平。体外实验表明激活AKT/m TOR可以增加OLs和神经元共培养体系中的成熟OLs的占比以及髓鞘化水平。因此,在前期发现基础上,本研究选用化学遗传技术中的特定药物激活特定受体技术(designer receptors executively activated by designer drugs,DREADDs)双向调控M1区神经元电活动,构建胸10(T10)背侧皮质脊髓束(dorsal corticospinal tract,d CST)轻度挫裂伤模型开展本研究。同时,我们对动物进行为期4W的雷帕霉素(rapamycin,RAPA)注射以抑制AKT/m TOR通路,检测OPCs的增殖、分化以及髓鞘化水平,同时检测动物运动功能变化情况,以探索神经元电活动调控d CST再髓鞘化的修复机制。实验方法:1.DREADDs病毒经脑立体定位注射:激活型:p AAV-h Syn-HA-h M3D(Gq)-IRES-m Citrine,抑制型:p AAV8-h Syn-h M4D(Gi)-m Cherry,注射2W后,所有动物造模(T10打击模型),其中激活组和抑制组在伤后2W给予N-氧化氯氮平(clozapine N-oxide,CNO)腹腔注射,对照组给予相应体重等量生理盐水注射。2.构建T10轻度脊髓打击伤模型:使用Allen’s打击器,打击力度为5g×2.5mm,伤后进行BMS评分,以评估动物损伤严重程度,用免疫荧光及蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测相关蛋白变化,评估髓鞘修复情况。3.行为学检测:本研究主要采用BMS和不规则水平楼梯对动物行为学进行检测以评估动物运动功能恢复情况,BMS检测时间点为:伤前(pre-SCI)、伤后SCI1D、SCI3D、SCI1W、腹腔注射后1W、2W、4W;不规则水平楼梯检测时间点为:伤前(pre-SCI),伤后1W,伤后3W、4W、6W。4.组织检测:选用电镜、免疫荧光、WB等方式对小鼠的脑皮层及脊髓进行检测,评估病毒表达效果,以及损伤处髓鞘修复情况。5.腹腔注射雷帕霉素,以抑制AKT/m TOR通路,评估动物的组织学、行为学表现,以研究神经元电活动调控脊髓损伤髓鞘修复的分子机制。结果:1.两组病毒注射后,小鼠皮质M1区神经元的神经原癌基因蛋白(c-Fos)表现出不同的表达水平。其中,激活组(h M3D(Gq)-CNO)c-Fos表达增多,抑制组(h M4D(Gi)-CNO)表达减少(P<0.001)。2.提高神经元电活动后,髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的免疫荧光强度及WB表达量显著增高(P<0.001),抑制组MBP的免疫荧光强度及WB表达量低于其他组(P<0.001)。正在增殖中的少突胶质细胞(Ki67+/Pdgf Rα+/DAPI+)以及成熟期的少突胶质细胞(APC/CC1+/Olig2+/DAPI+)激活组显著高于其他三组(P<0.01),抑制组低于其他三组(P<0.01)。3.与其他3组相比,激活组BMS评分在腹腔注射CNO 4W时最高(P<0.05),水平楼梯检测失误率在腹腔注射CNO 4W时最低(P<0.01)。4.提高神经元电活动后,脊髓AKT/m TOR通路蛋白PS6表达相较于其他三组明显增加(P<0.01),抑制组PS6表达减少(P<0.01),对照组组间无差异(P>0.05)。5.提高神经元电活动同时抑制m TOR通路,脊髓MBP的免疫荧光强度及蛋白表达量(WB)均明显下降(P<0.001),增殖中的少突胶质细胞(Ki67+/Pdgf Rα+/DAPI+)以及成熟期OLs(APC/CC1+/Olig2+/DAPI+)明显减少。结论:1.利用化学遗传法(DREADDs)技术能够有效的对皮层神经元电活动进行双向调控。2.提高神经元电活动能够促进T10脊髓挫裂伤后小鼠的少突胶质细胞的增殖、分化以及髓鞘修复;反之,抑制神经元电活动则会抑制少突胶质细胞的增殖、分化以及髓鞘修复。3.提高神经元电活动促进T10脊髓挫裂伤小鼠后肢运动功能的恢复。4.AKT/mTOR通路的激活是介导神经元电活动促脊髓损伤后髓鞘修复及运动功能恢复的分子机制。