近年来,超分辨率光学显微术的发展极大地推动了细胞生物学和纳米材料学等领域的发展。超分辨光学显微术主要被分为两大类:第一类是结构光照明显微技术,它通过对衍射极限范围内分子的荧光行为进行空间调制,使得荧光的发光点小于衍射极限。这类技术的典型代表是受激发射损耗显微术(STED)。第二类是随机单分子定位显微术(SMLM),重构出一副超高分辨率的图像。其典型代表有随机光重建显微术(STORM)、光敏定位显微术(PALM)等。而点扫描光学显微系统是构建第一类超分辨率显微系统,例如受激发射损耗显微系统的重要基础平台。点扫描光学显微系统对推动超分辨率光学显微技术的发展有着重要的作用。本文旨在构建一种基于点照明、点探测的点扫描光学显微系统,并对其成像关键技术进行研究。文中首先概述了点扫描光学显微技术的原理及应用,并论述了衍射极限与分辨率之间的关系。结合时间相关单光子计数技术的优势,提出并研制了具有良好横向和纵向扫描能力的点扫描光学显微系统,主要包括硬件、软件、扫描控制以及光学系统等。解决了系统研制过程中的数据采集与处理、系统同步控制、照明光的产生、荧光光子的探测、系统调节与优化等关键问题。最终,建立测试模型,测试并验证了成像系统的性能。本文的创新性和贡献主要有:1.提出并研制了稳定性强、结构简单的点扫描光学显微系统,为受激发射损耗显微系统的构建创造了良好的条件。利用构建的点扫描光学显微系统,对40nm的荧光小球扫描成像,获得了 394nm的横向分辨率。2.设计并开发了功能完备、操作简单的成像软件,不仅实现了数据的采集和图像的重建,而且在软件层实现了系统的同步控制。该软件可以被应用于共聚焦、受激发射损耗、双光子等点扫描光学显微系统。3.设计并实现了稳固的荧光探测系统,可以高效的探测荧光光子信号,并能有效抑制环境噪声的干扰,提高显微系统的信噪比。4.使用CCD大视场的观测方法,可以快速查找成像焦面的位置,既节省了实验时间,又提高了工作效率。5.对荧光分子的强度调制进行了初步的探索,利用构建的点扫描光学显微系统实现了 ATTO590染料染色的纤维样品在不同偏振角度下的扫描成像,在实验中初步证实了荧光分子光强的偏振依赖性。