生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus-2HSV-2),感染引起的常见病毒性性传播疾病(Serxual transmitted disease STD),是STD门诊生殖器溃疡最主要的原因。HSV-2可以通过多种途径感染宿主,而其中泌尿生殖道黏膜最易感染,主要表现为外生殖器簇集性小水疱、脓疱或糜烂、溃疡。慢性宫颈炎是妇科常见病,临床表现多为宫颈糜烂样改变,其病因复杂。近年来的研究表明多种性传播疾病与宫颈炎和宫颈癌的发病密切相关。其中HSV-2感染具有反复发作的特点,其活动感染与宫颈柱状上皮移位的产生相关性已逐渐引起了人们的重视。由于宫颈本身结构特殊性,HSV-2感染宫颈后不易被确诊,病毒反复发作使宫颈局部充血或溃疡,又易合并其它感染,加速了局部的病理损害,使急性宫颈炎容易转化为慢性宫颈炎,而宫颈糜烂样改变程度不断加重,形成恶性循环。HSV-2感染后病毒反复发作可刺激宫颈上皮非典型增生和鳞状上皮化生,其与HPV协同引发宫颈癌发生也已引起越来越多的关注。近年来生殖器疱疹合并宫颈柱状上皮移位检出率增多,国外在对宫颈分泌物检查中发现HSV-2的感染率达32.9%。因此,在临床上遇到宫颈柱状上皮移位反复发作的患者,不可忽视对其进行单纯疱疹病毒检测。临床上监测HSV-2排泌的主要方法为病毒分离培养法和聚合酶链反应(Polymerase chain reaction PCR)法,其中病毒培养法作为检测HSV-2金标准,但该方法操作繁琐,周期长,技术要求高,不易分型,而且检测结果受转运时间及转运时是否冷冻处理的影响很大,临床常规应用有很大的局限性。PCR法比病毒分离培养法敏感性高、需要时间短,具有特异、敏感、快速的特点,可大大提高诊断的准确性,并为临床的早期诊断和治疗提供重要依据,现已在临床上逐渐使用。由于HSV-2感染具有潜伏性和反复发作的特点,一直都是临床治疗面临的难点和研究方向,目前药物治疗、例如阿昔洛韦、伐昔洛韦,可用于缩短病程,减少复发次数,虽然目前抗病毒药物在治疗普通人群疱疹病毒感染上暂未见大量耐药性的报道,但对于免疫损害如HIV感染、器官移植患者抗病毒药物抵抗已达到14%,且随着医学水平进步,器官移植患者增加,移植术后需服用药物抑制排异反应,此时患者免疫系统处于抑制状态,使得HSV-2感染更易发作。此类患者疱疹感染常表现为频繁复发,累及多个部位,病毒排放时间延长,病程长,一些病例累及多个内脏器官。药物的耐药性对AIDS患者或者进行器官移植的疱疹患者治疗产生新的问题。选择有效、安全性好、可重复的治疗方法,以达到控制病情、缓解患者痛苦目的,为临床上亟待解决的问题。光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)是给予人体某种光敏剂,这些光敏剂可选择性积聚于病变部位,经与之相应波长的激光照射后,光敏剂即产生游离的原子团、氧自由基,通过生物光敏化作用引起病变部位细胞损害,达到治疗疾病的目的。是一种微侵袭性、能引起局部组织破坏的、非产热性治疗手段。随着新型光敏剂的研究和对光动力学疗法机制研究的不断深入,光动力疗法在皮肤科的适应症已经从皮肤肿瘤拓展到多种良性皮肤疾病的,如鲜红斑痣、光线性角化病及痤疮、银屑病的治疗,近年来的研究还尝试将PDT用于病毒疾病的治疗,光动力疗法杀灭病毒的机制是卟啉类光敏剂与构成病毒包膜整体部分的脂类和糖脂具有亲和力,由于病毒的包膜来自于病毒寄生的细胞原生质膜。所以被病毒感染的细胞胞膜和病毒包膜为光敏剂的结合部位。经光敏化作用后,被病毒感染的细胞胞膜和病毒包膜的完整性被破坏。单纯疱疹病毒是有包膜的病毒,光动力疗法对其有直接灭活作用。光动力疗法作用后病毒的立早期基因ICP027、晚期基因VP16和gD的水平均下降,因此有专家推测光动力可通过干扰病毒复制所必须的基因的合成而抑制病毒的增殖。而正常组织中因为光敏剂的蓄积少,不引起光敏化作用,因此对正常组织细胞无影响。目前有研究报道表明采用证明光动力学疗法对体外HSV-1有直接灭活作用,另有国外文献报道采用光动力疗法治疗复发性口唇疱疹能减轻患者症状、降低复发次数。研究目的：生殖器疱疹的发病率高,对HSV-2感染的早期诊断、进行治疗有助于有效控制疾病传播。本研究从检测及治疗方面入手,以期为临床诊断及治疗方面提供实验室参考。研究内容：1.采用实时定量PCR法对宫颈柱状上皮移位患者宫颈棉拭子标本中HSV-2进行检测,了解宫颈柱状上皮移位患者HSV-2感染的情况,评估宫颈柱状上皮移位和HSV-2感染之间的关系。2.以感染HSV-2333标准株的人角质形成细胞(Human Keratinocytes HaCat)株为研究对象,通过加入一定浓度的光敏剂5-氨基酮戊酸(5-aminolexulinic acid5-ALA)及不同能量密度632nm波长半导体激光对体外HSV-2病毒进行处理,研究5-ALA-PDT对体外HSV-2的杀灭作用,为探讨5-ALA-PDT治疗生殖器疱疹的可行性提供初步实验室依据。方法：1.采用Real-timePCR法对皮肤科及妇产科门诊262例患者取宫颈分泌物棉拭子标本进行检测HSV-2,患者均无生殖器疱疹病史,以宫颈炎、阴道分泌物异常就诊患者。同时以87例宫颈光滑、外观正常的同期健康体检妇女为对照组,比较两组HSV-2的感染情况及宫颈糜烂样改变程度与HSV-2的关系。2.将体外培养的HaCat细胞分别加入不同浓度的5-ALA(0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4mmol/L)孵育3h,予不同能量密度(0、6、9、12、15、18、21J/cm2)632nm波长激光照射,四唑盐(MTT)比色法测定细胞存活率。观察不同药物浓度及激光能量对角质形成细胞的影响。选取对角质形成细胞无影响的临界浓度及激光能量,为探讨5-ALA-PDT对HSV-2的作用做准备。3.(1)PDT对细胞外HSV-2的处理：已经作用3h后的0.5mmol/1的ALA溶液和HSV-2病毒原液的混合液接种于细HaCat细胞胞上,予以不同能量密度(6、9、12、15J/cm2)激光照射。(2)PDT对细胞内HSV-2病毒处理：将HaCat细胞接种HSV-2病毒原液,出现CPE后予以不同能量密度(6、9、12、15J/cm2)激光照射。以上两种情况照射2天后,MTT法测定各孔的OD值,计算细胞保护率。探讨5-ALA-PDT对HSV-2的杀灭作用。结果：1.宫颈棉拭子标本HSV-2检出率宫颈柱状上皮移位患者262例,其HSV-2检出率30.9%,正常对照组87例中HSV-2检出率9.2%,两组的差异有统计学意义(χ2=16.21,P<0.001)。宫颈柱状上皮移位患者宫颈分泌物HSV-2检出率较宫颈正常高。2.宫颈糜烂样改变程度与HSV-2检出率的关系宫颈糜烂样改变轻、中和重度患者中,HSV-2阳性率分别为17.0%、27.9%、47.7%。不同程度的宫颈糜烂样改变患者之间其HSV-2检出率有差异(Z=-4.395,p<0.001),重度宫颈糜烂样改变患者的HSV-2检出率最高。宫颈糜烂样改变程度与HSV-2的阳性率呈正相关(rs=0.272,P<0.050),即随着宫颈糜烂样改变程度增加,HSV-2阳性率也增加。3.采用光动力疗法选择不同药物浓度及激光能量作用于HaCat时：5-ALA-PDT的浓度不同对HaCat细胞存活率的影响也不同(F=1178.32,p<0.001),除0mmol/l浓度组与0.25mmol/l浓度组间不存在统计学差异外,其他各组之间均存在统计学差异(p<0.001)；能量密度不同对HaCat细胞的影响也不同(F=1001.56,p<0.001)),除18J/CM2与21J/CM2间生存率无统计学差异外,其他各组间均存在统计学差异(p<0.001)。浓度组和能量组间存在交互效应(F=60.58,p<0.001)。4.5-ALA-PDT作用于HSV-2(1)5-ALA-PDT对细胞外HSV-2的杀伤作用：各组间的存活率差异有统计学意义(F=79.38,p<0.001)；当5-ALA-PDT浓度在0.5mmol/l时,随着能量密度的增大,细胞存活率逐渐增大。病毒对照组、0.5mmol/l.6J/CM2、0.5mmol/l.9J/CM2与细胞对照组之间的差异具有统计学意义(p<0.001)；细胞对照组和能量组0.5mmol/l.9J/cm2、0.5mmol/l.12J/cm2、0.5mmol/l.15J/cm2与病毒对照组之间的差异有统计学意义(p<0.001)；(2)5-ALA-PDT对HaCat细胞内HSV-2杀伤：各组间的存活率差异有统计学意义(F=17.01,p<0.001)。当5-ALA-PDT浓度在0.5mmol/l时,随着能量密度的增大,细胞存活率逐渐增大。病毒组和0.5mmol/1ALA.6J/cm20.5mmol/LALA.9J/cm20.5mmol/LALA.12J/cm2组细胞存活率与细胞对照组差异有统计学意义(p<0.001),细胞对照组和能量组12J/cm2组、15J/cm2与病毒对照组存活率差异有统计学意义(p<0.001)。结论：1.宫颈柱状上皮移位患者宫颈分泌物HSV-2检出率较宫颈正常患者高。在宫颈柱状上皮移位患者中,随着宫颈糜烂样改变程度增加,HSV-2阳性率也明显增加。HSV-2检出率与宫颈糜烂样改变程度相关。2.5-ALA-PDT对细胞外HSV-2有直接杀灭作用,能保护HaCat细胞不受感染；对已经出现CPE病变的HaCat,能抑制细胞内病毒的复制,减少病毒对周围细胞的损伤。