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研究背景纳米材料是当今科研发展最为热门的领域之一,各种生物纳米材料已经广泛地用于生物医学领域。纳米载体材料,必须具有良好的生物相容性,才能确保安全的应用于医学领域。纳米载体材料的生物相容性评价主要包括：血液相容性,免疫相容性与全身毒性等。不引起明显的临床反应,及能耐受宿主各系统的作用而保持相对稳定,不被排斥和破坏的生物性原则,评价为纳米载体材料相容性良好。纳米载体材料进入机体后,不可避免的将与血液接触,不仅会与血液系统中的血细胞和蛋白产生各种反应,而且还能够被宿主的免疫系统识别,产生复杂的免疫反应。纳米载体材料的血液相容性与免疫相容性研究,具有重要的理论和临床价值。单壁碳纳米管(Single-Walled Carbon Nanotubes, SWCNTs),作为一种纳米载体材料,在生物医药领域主要用作靶向药物载体、基因载体等。由于单壁碳纳米管(SWCNTs)在独特的生物化学性质,在水溶液很难分散、容易聚集,给实际应用带来了巨大的困难。解决这一难题的方法,主要包括化学修饰(表面添加官能团)和物理修饰(表面结合溶解剂,不改变化学结构)。不管用那种方法进行处理,单壁碳纳米管作为生物医药载体应用时,了解它的血液相容性对于单壁碳纳米管的安全使用具有重要意义。虽然己有诸多文献研究报道,碳纳米管会降低血管内皮细胞的活性,促进内源性凝血,诱发血小板的活化和聚集等,但是关于羧基化单壁碳纳米管对红细胞的作用以及对血栓力学性质和凝血过程的影响的报道十分有限。聚酰胺-胺(Polyamidoamine,PAMAM)作为一种新型纳米材料是目前研究最为深入和广泛的树状大分子,根据末端所带官能团的不同,目前市售聚酰胺-胺(PAMAM)主要分为PAMAM-NH2、PAMAM-OH、PAMAM-COOH、 PAMAM-C12、PAMAM-NH2/OH(混合表面)及PAMAMOS-TMOS(有机硅表面)等,其中尤以前三种研究最为广泛。聚酰胺-胺(PAMAM)在生物医药领域的主要用作靶向药物载体、基因载体、造影剂等。这些纳米载体材料在实际应用中,它们将对机体产生怎样的影响,同时,它们的生物医用功能是否会发生改变等。这些问题对于聚酰胺-胺(PAMAM)安全使用到医学领域至关重要。因此,我们选用单壁碳纳米管(SWCNTs)为模型,对其表面进行化学氧化修饰,进一步研究其对血液中红细胞形貌和凝血功能的影响。此外,我们还选用聚酰胺-胺(PAMAM)为模型,采用生物化学、细胞及分子生物学以及免疫学等研究手段,着力探讨该聚合物所带不同表面官能团(氨基(-NH2)、羟基(-COOH)、羧基(-OH)),所引发的免疫应答将会发生怎样的变化,初步阐明聚酰胺-胺(PAMAM)的不同表面基团对免疫分子、免疫细胞、抗原抗体反应及补体激活的影响。本研究,将为规避新型纳米载体材料的应用风险提供科学依据,推动新型纳米载体材料的优化设计和应用,筛选及优化具有免疫调控功能的纳米载体材料用于免疫治疗。研究内容第一章羧基化单壁碳纳米管的制备与其血液相容性研究[目的]本研究旨在对单壁碳纳米管(SWCNTs)进行羧基化改性并对改性前后的SWCNTs进行血液相容性研究。[方法]利用浓硫酸与浓硝酸(3：1,v/v)在加热条件下将单壁碳纳米管(SWCNTs)氧化成羧基化单壁碳纳米管(SWCNT-COOH),采用红外光谱仪(FTIR)、马尔文激光粒径仪对材料粒径和表面电荷进行表征。采用扫描电子显微镜(TEM)观察修饰前后的SWCNTs对红细胞聚集和形貌的影响。采用血栓弹力图仪(TEG)检测修饰前后的SWCNTs对凝血功能的影响。[结果]利用浓硫酸与浓硝酸化学氧化法成功地将SWCNT表面进行羧基化处理。10mg/mL的SWCNT-COOH引起红细胞聚集和形貌变化。0.01 mg/ml SWCNTs和0.001 mg/mL SWCNT-COOH促进了凝血因子的活化。[结论]用浓硫酸和浓硝酸化学氧化法可有效地制备SWCNT-COOH。通过红细胞形态观察和凝血实验,揭示了SWCNTs和SWCNT-COOH的血液相容性,为SWCNT-COOH的优化设计和生物医学应用提供了重要的依据。第二章聚酰胺-胺(PAMAM)免疫相容性的初步研究[目的]深入阐明聚酰胺-胺(PAMAM)的不同表面基团(氨基、羟基、羧基)对免疫分子、免疫细胞、抗原抗体反应及补体激活的影响。[方法]采用紫外光谱学、荧光光谱学和圆二色普光谱学来研究聚酰胺-胺(PAMAM)对γ-球蛋白结构和构象的影响。通过酶联免疫吸附实验检测研究聚酰胺-胺(PAMAM)对补体激活的影响。采用红细胞凝集实验研究聚酰胺-胺(PAMAM)对抗原抗体反应的影响。此外,通过细胞毒性实验研究聚酰胺-胺(PAMAM)对RAW265.7细胞的毒性,以及利用吞噬实验来研究聚酰胺-胺(PAMAM)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。[结果]聚酰胺-胺(PAMAM)能够改变γ-球蛋白的结构和构象,抑制补体激活。第5代末端带有羧基(-COOH)的聚酰胺-胺(PAMAM)在10mg/mL会破坏红细胞的抗原抗体反应。末端所带的官能团不同(氨基、羟基、羧基)的聚酰胺-胺(PAMAM)对RAW264.7细胞的毒性也一样,G5 PAMAM-NH2(氨基)>G5 PAMAM-COOH(羧基)>G5 PAMAM-OH(羟基),而羟基的没产生细胞毒性。从形态上观察,聚酰胺-胺(PAMAM)对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能没有影响。[结论]聚酰胺-胺(PAMAM)对免疫分子和免疫细胞、以及免疫应答的影响主要依赖它们的整体结构和表面所带的官能团。