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蛇毒蛋白中存在许多能影响机体止血系统的蛋白质和多肽，这些蛇毒蛋白和多肽主要通过特异性激活prothrombin、FactorX、FactorV、FactorVII等凝血因子，直接凝集纤维蛋白原以及促进血小板聚集等方式来促进血液凝固。蛇毒凝血酶原激活酶是通过激活凝血酶原生成凝血酶来促进血液凝固。迄今为止已经从蛇毒中分离纯化出多种蛇毒凝血酶原激活酶。烙铁头蛇毒的研究主要集中在纤溶活性和抗凝活性方面。然而，对促凝活性组分的分离纯化及性质研究的报道却很少，目前也没有烙铁头凝血酶原激活酶被开发应用于临床。
目的：
本课题从湖南产烙铁头的蛇毒干粉中探寻一个能够促进血液凝固的蛋白分子，着力研究其理化性质、生物活性、酶学特征及促凝血作用机制等相关内容。
方法：
1.利用CM-Sephadex C-50阳离子交换层析，SP Sepharose High Performance阳离子交换层析及Blue Sepharose6 Fast Flow亲和凝胶层析这三步分离纯化技术，从烙铁头蛇毒的粗毒中分离纯化目的产物FVbc；
2.利用SDS-PAGE鉴定FVbc的纯度；
3.利用MALDI-4800-TOF-TOF质谱仪测定FVbc的分子量；
4.利用等电聚焦电泳法测定FVbc的等电点；
5.采用Edman降解法测定FVbc的N端序列，再利用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi系统进行蛋白质N端序列同源性比对；
6.采用R.Rajesh和Williams的方法把FVbc与PPP相互作用，研究FVbc对PPP的体外凝固作用；以凝血酶为参照品研究FVbc的体外凝血活力；
7.采用Rong Gao和Manjunatha的方法，配置FVbc与纤维蛋白原溶液相互作用的反应体系，在37℃下温育，研究FVbc对纤维蛋白原的直接凝固作用；
8.采用特异性显色底物法，配置FVbc与凝血酶原相互作用的反应体系和FVbc与凝血因子X相互作用的反应体系，在37℃下温育，然后将各反应体系与各自特异性显色底物相互作用，研究FVbc对凝血酶原和凝血因子X的激活作用；
9.配置FVbc与凝血酶原相互作用的反应体系，在37℃下温育，通过SDS-PAGE研究FVbc对凝血酶原的降解作用；
10.采用特异性显色底物法测定不同温度、不同PH、不同浓度钙离子以及不同金属离子对FVbc酶活性的影响；
11.配置FVbc与抑制剂相互作用反应体系，在37℃下温育15min后，接着将反应体系与凝血酶原相互作用，在37℃下温育5min，再通过SDS-PAGE研究不同抑制剂对FVbc酶活性的影响。
结果：
1.烙铁头蛇毒经三步分离纯化后得到具有体外促进血浆凝固作用的组分FVbc，回收率为0.25％。FVbc为单链蛋白质，精确分子量为25358.650Da，等电点主带为5.4，在4.9处有一条弱带分布，FVbc的N端10个氨基酸序列分别为NH2-V-I-G-X-D-E-X-N-I-N；
2.FVbc具有体外凝血活性，凝血活力为1.5NIH U/mg；当FVbc的浓度为2mg/ml时，PPP的凝固时间为47s左右，FVbc的体外促凝作用呈现量效关系；
3.FVbc的浓度为4mg/ml，经过12h的观察，发现FVbc仍然不能使纤维蛋白原溶液凝固；FVbc与凝血因子X相互作用的反应体系不能使FactorXa的特异性显色底物显色；FVbc与凝血酶原相互作用的反应体系可以使凝血酶的特异性显色底物显色，且该作用呈量效、时效关系；
4.FVbc能够水解凝血酶原的Arg322-Ile323肽键，生成初级中间产物Meizothrombin，从而活化凝血酶原生成凝血酶；
5.FVbc的适宜PH为PH5.5-7.5，适宜温度为30-40℃；FVbc的酶活性呈现非钙离子依赖性，Ba2+和Mg2+可增强FVbc的酶活性，Cu2+、Zn2+和Ni2+可抑制FVbc的酶活性；金属蛋白酶抑制剂EDTA和EGTA也可以不同程度的抑制FVbc的酶活性，而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、Aprotinin对FVbc的酶活性没有影响。
结论：
1.烙铁头蛇毒的粗毒经过CM-Sephadex C-50阳离子交换层析、SP SepharoseHigh Performance阳离子交换层析及Blue Sepharose6 Fast Flow亲和凝胶层析的三步分离纯化后，最终得到具有促凝作用的目的产物FVbc；FVbc属于第Ⅰ类蛇毒凝血酶原激活酶。
2.FVbc的精确分子量为25358.650Da，等电点主带为5.4，在4.9处有一条弱带分布，其N端10个氨基酸序列分别为NH2-V-I-G-X-D-E-X-N-I-N；FVbc酶活性的适宜PH为5.5-7.5，适宜温度为30-40℃。
3.FVbc通过水解凝血酶原的Arg322-Ile323肽键激活凝血酶原生成凝血酶，从而发挥促凝作用。