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炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是胃肠道慢性炎症性疾病,由于持续时间久、易复发导致其难以根治。目前用于临床一线治疗的药物主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素及抗肿瘤坏死因子等。然而,现有的药物治疗效果有限且具有较高的副作用,因此IBD的治疗仍面临挑战。近年来,研究者密切关注肠道菌群与IBD的关系,如在IBD期间菌群失调,特别是肠杆菌科的异常增殖,会导致肠道炎症加剧和肠黏膜屏障受损,基于肠道微生物的治疗旨在恢复肠道微生物平衡,成为缓解和治疗IBD的新策略。其中,钨酸盐可失活钼依赖性呼吸酶活性（肠杆菌呼吸途径关键酶）进而抑制IBD期间肠杆菌科的非正常增殖,恢复肠道菌群稳态。然而,钨酸盐会影响亚硫酸盐氧化酶或黄嘌呤氧化酶等钼依赖性酶活性,产生严重的副作用。因此,发展更特异、有效和安全的肠道微生物治疗策略对于IBD治疗具有重要的意义。基于此,本文构建了酵母细胞壁（yeast cell wall,YCW）包裹的钨酸钙纳米粒（CaWO4@YCW）口服递送系统,用于精准、高效和安全的抑制肠杆菌的增殖恢复失调的肠道菌群。首先,YCW不仅可提高CaWO4在胃液中的稳定性,而且由于其表面含有大量甘露聚糖,具有肠杆菌科靶向性,可实现对肠杆菌的精准靶向。其次,CaWO4纳米粒在钙卫蛋白（Calprotectin,CP）（IBD期间应激增加的钙结合蛋白）作用下剥夺Ca2+释放出游离钨,钨离子(W6+)取代钼离子抑制肠杆菌科的扩张。靶向递送以及响应炎症微环境释放W6+提高药物释放的精准度,减少非病变部位的聚集,进而提高了治疗效果和生物安全性。具体研究内容如下:1.CaWO4纳米粒的制备及表征首先以钨酸钠和硝酸钙为原料,去离子水为溶剂,聚乙二醇200（PEG 200）为表面活性剂合成钨酸钙纳米粒,通过红外光谱（Infrared Spectroscopy,IR）、X射线衍射仪（X-ray Powder Diffraction,XRD）以及透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）等表征手段,证明CaWO4纳米粒的成功合成。透射电镜、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）及动态光散射仪（Dynamic Laser light Scattering,DLS）等表征均证实,制备的钨酸钙纳米粒呈现较为规则的球形结构,大小均一,平均粒径约为850 nm。2.CP介导的CaWO4纳米粒W离子释放及对肠杆菌活性抑制作用首先,构建原核表达载体pET28a—h S100A8和pET28a—h S100A9,将其分别转入表达菌株,经异丙基硫代β-D半乳糖苷（Isopropylthio-β-D-galacgoside,IPTG）诱导菌株表达得到了钙卫蛋白（CP）,再经Ni-NTA-His亲和层析纯化得到了纯度较高的目的蛋白。CP具有金属离子结合位点,其中对Ca2+的亲和力高于其他二价离子。在验证CP与CaWO4的相互作用过程中,通过荧光检测发现CP会使CaWO4的荧光强度降低,粒径变小可由DLS粒径检测和SEM结果得到验证,此外,在CaWO4溶液中加入CP能看到溶液由浑浊变得较为澄清,根据这些结果推测是由CP剥夺CaWO4中的Ca2+导致CaWO4形态的改变。为了验证推测,将CaWO4纳米粒和CP共孵育后用电感耦合等离子体质谱仪（Inductively coupled plasma mass,ICP-MS）检测沉淀和上清中钙元素和钨元素含量,结果发现,随着CP浓度的增加上清中Ca、W元素的释放量增加。最后,通过检测硝酸还原酶活性和体外抗菌实验,发现与Control组相比加入CP后,硝酸还原酶活性降低了2-4倍,抑菌实验中大肠杆菌1917和DH5α分别减少了约6和6.5倍,对肠杆菌K12的影响更大,减少了30倍,这些结果证明CP介导的特异性W离子释放可高效降低硝酸还原酶的活性,进而显著抑制了肠杆菌的增殖。3.CaWO4@YCW的制备及体外性能考察为了进一步增强CaWO4纳米粒对肠杆菌的靶向性和胃肠道稳定性,通过先超声后挤膜的方式将YCW碎片包裹在CaWO4纳米粒的表面,从而构建精准调控肠道菌群的CaWO4@YCW口服递送系统。通过透射电镜,扫描电镜和激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）和流式细胞术等实验,表明CaWO4@YCW成功构建。DLS测量结果表明,CaWO4@YCW相比于CaWO4粒径明显增大,平均粒径约为1.4μm,Zeta电位约为-17.8 m V。为了CaWO4的可视化,在合成过程中掺杂了铽离子,铽离子的加入增强了Tb3+:CaWO4的发光性能,同样的方法将YCW包覆在Tb3+:CaWO4表面得到Tb3+:CaWO4@YCW,用于后续共定位实验。构建大肠杆菌感染的斑马鱼模型验证了Tb3+:CaWO4@YCW对肠杆菌的靶向性。根据CLSM图像显示,Tb3+:CaWO4@YCW和大肠杆菌共定位,而游离的Tb3+:CaWO4较少定位于感染区域,表明YCW的加入使得Tb3+:CaWO4@YCW有效识别和黏附大肠杆菌。为了考察包膜后对胃肠道恶劣环境的抵抗能力,通过CLSM观察YCW在胃液和胆盐中的稳定性,经模拟胃液和胆盐处理2 h后仍能与Tb3+:CaWO4共定位,说明YCW具有高度的稳定性。4.CaWO4@YCW体内对肠杆菌科调控以及肠炎治疗效果的研究通过给6周龄的雌性C57BL/6小鼠喂养3%硫酸葡聚糖钠盐（Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS）构建IBD模型,考察了CaWO4@YCW在体内对肠杆菌科的调控以及对急性结肠炎的治疗效果。小鼠连续7天灌胃给予0.3 mmol/kg/d的含钨制剂,在最后一天收集小鼠粪便并对大肠杆菌进行菌落计数,与DSS组相比CaWO4@YCW组肠杆菌的数量降低了7倍,说明CaWO4@YCW在体内对肠杆菌有更高效的抑制作用。此外,通过16S r DNA扩增子测序对粪便样本V4区的分析显示,与其他对照组相比,CaWO4@YCW治疗组明显增加了菌群的丰富度（OTU丰富度）和多样性（Shannon和simpson、chao1指数）。同时,显著降低了肠杆菌的丰度,增加了厚壁菌门瘤胃球菌和毛螺菌属以及拟杆菌门梭菌属等益生菌的丰度,逆转结肠炎引起的肠道菌群失调。通过以下实验考察了缓解结肠炎的效果。与对照组相比,经CaWO4@YCW治疗明显缓解了因肠炎导致的体重下降和结肠的缩短。酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA）结果表明CaWO4@YCW治疗显著降低了小鼠血清中促炎细胞因子的水平,例如白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-6,同时提高了抗炎细胞因子的水平,如IL-10和转化生长因子TGF-β。通过结肠部位H＆E组织病理学观察,TUNEL,ZO-1和Occludin-1免疫荧光双标等结果,进一步说明CaWO4@YCW治疗有更好的减轻肠道损伤及修复肠道屏障的效果。为了考察治疗后钨离子的体内分布,采用ICP-MS检测了不同处理组各组织中W元素的含量。CaWO4@YCW在心、肺、骨骼、脾、肝、和肾中的沉积显著降低（分别比Na2WO4低5.7、4.7、3.4、2.2、3.7和2.3倍）,而在结肠和粪便中的积累水平较高（比Na2WO4高2.8倍和2.7倍）,说明口服水溶性Na2WO4,更易造成钨离子的全身分布,存在体内全身副作用的风险,而CaWO4@YCW显著降低W离子在体内的不正常分布,降低了W离子在全身的暴露。最后,CaWO4@YCW治疗后血常规、血生化指标以及主要器官的H＆E未见其异常,表明口服CaWO4@YCW具有较高的安全性。综上所述,本文围绕如何更特异、有效和安全调控IBD菌群失调的关键问题进行了探讨,利用YCW包裹CaWO4纳米粒,构建了钨离子控释型口服递送系统。利用体内炎症部位的特性（CP的高表达）以及YCW富含的甘露聚糖,实现了精准靶向、安全且高效的抑制肠杆菌增殖,逆转IBD引起的肠道菌群失调,为实现更精准的肠道菌群调控提供一种新策略。