微管是真核细胞骨架成分,参与细胞有丝分裂中纺锤体的形成。作用于秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂可以有效抑制微管蛋白聚合,抑制肿瘤的发生发展。同时,作用于β-微管蛋白秋水仙碱结合位点的药物具有水溶性好、过敏反应少等优点。而此类抗肿瘤药物目前还未见产品上市,具有广阔的研发前景。Hippo通路的相关蛋白主要定位于细胞质内,其中YAP是Hippo通路的主要下游效应因子。YAP异常激活会使细胞产生增殖异常性、化学耐药性和转移性。并且YAP可通过诱导其他原癌转录因子加强对肿瘤细胞的作用。因此,抑制肿瘤细胞中YAP蛋白的功能成为重要的研究方向。Hippo通路的激活将导致YAP失活,进而产生抑制肿瘤的作用。而研究表明,除此途径外,通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解YAP也是调控其功能的重要方式。NEDDylation是一种类泛素化过程,可以调控多种蛋白质的降解平衡,与UPS有着重要的联系,它可以通过E1、E2、E3酶的作用将类泛素分子NEDD8修饰在目标蛋白上,进而调控蛋白质的活性或使目标蛋白通过UPS降解。磺酰胺骨架经常被设计为抗有丝分裂类药物,作用于秋水仙碱结合位点抑制微管蛋白聚合,具有较好的抗肿瘤活性。本论文以磺酰胺为基本骨架,利用分子拼接原理,得到了磺酰胺类系列化合物。并对合成的化合物进行了体外抗肿瘤活性评价和体内外抗肿瘤机制研究。具体内容如下:1.磺酰胺类系列化合物体外抗肿瘤活性评价本课题组以磺酰胺为基本骨架,利用分子拼接原理,将抗肿瘤活性片段拼合到磺酰胺骨架上,合成了新型磺酰胺类化合物。通过MTT法检测该系列化合物对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性。结果筛选出化合物1382具有最好的抗肿瘤活性,且优于阳性对照药秋水仙碱。进一步筛选发现化合物1382对胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的抗肿瘤效果最好。2.微管蛋白抑制作用的检测通过微管蛋白聚合实验、免疫荧光实验、碘乙酰胺竞争实验和分子对接实验发现化合物1382可以占据胃癌细胞β-微管蛋白秋水仙碱结合位点,有效抑制微管蛋白聚合。3.YAP蛋白抑制作用的检测通过蛋白免疫印迹实验和核质转移实验发现化合物1382抑制YAP蛋白水平和YAP质核转移。同时检测到化合物1382调控YAP的靶基因c-Myc和AXL的表达。但通过蛋白免疫印迹实验检测化合物1382抑制YAP蛋白与Hippo通路之间的关系,结果显示:化合物1382对YAP的抑制不是由Hippo通路的激活引起的。4.检测NEDDylation对YAP的调控作用本课题组前期工作表明,一些化合物可以通过激动NEDDylation促进YAP蛋白的降解。因此猜测化合物1382对YAP的作用与类泛素化修饰NEDDylation相关。通过蛋白免疫印迹实验、NEDDylation试剂盒、细胞热转变分析实验发现化合物1382可以激动NEDDylation。通过蛋白免疫印迹实验和转染实验进行化合物1382抑制YAP与激动NEDDylation相关性研究,结果显示:化合物1382可以激动NEDDylation通过UPS引起YAP降解。5.体外抗肿瘤机制研究通过流式细胞术、DAPI荧光染色实验、Calcein-AM/PI活/死细胞荧光染色实验和蛋白免疫印迹实验检测化合物1382对胃癌细胞凋亡作用,结果显示:化合物1382诱导胃癌细胞凋亡。通过生长曲线、克隆形成实验、流式细胞术和蛋白免疫印记实验检测化合物1382对胃癌细胞增殖作用,结果显示:化合物1382抑制胃癌细胞增殖,阻滞胃癌细胞周期在G2/M期。同时检测到化合物1382诱导胃癌细胞凋亡和周期阻滞部分依赖于激动NEDDylation通过UPS引起的YAP降解。6.体内抗肿瘤机制研究通过建立裸鼠移植瘤模型研究化合物1382体内抗肿瘤活性,结果显示:化合物1382降低了肿瘤体积和重量,有效抑制了肿瘤生长。通过肿瘤组织TUNEL染色检测化合物1382对肿瘤组织凋亡的作用,结果显示:化合物1382促进肿瘤组织细胞凋亡。通过免疫组化实验和蛋白免疫印迹实验检测化合物1382对裸鼠肿瘤组织YAP相关蛋白的影响,结果显示:化合物1382调控肿瘤组织中YAP相关蛋白、凋亡相关和周期相关蛋白。通过测量裸鼠体重和脏器切片H＆E染色评价化合物1382体内安全性,结果显示:化合物1382体内没有表现出明显毒性,具有较好的体内安全性。综上所述,体外抗肿瘤机制研究表明,新型磺酰胺类化合物1382抑制胃癌细胞微管蛋白聚合,并激动NEDDylation通过UPS引起YAP的降解。体内抗肿瘤机制研究表明,化合物1382在体内与体外作用机制相同,都可以抑制YAP蛋白,诱导胃癌细胞凋亡和周期阻滞。作为微管蛋白和YAP的双重抑制剂,化合物1382有效的促进了胃癌细胞凋亡和增殖抑制。