食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌在我国的主要病理分型,约占全部食管癌病例的90%,其具有较高的发病率和死亡率。尽管目前有包括手术、化疗和放疗在内的多学科治疗手段,但食管癌患者的预后仍然不佳。传统疗法对治疗效果的改善有限,导致了对ESCC革命性治疗策略的探索,尤其是靶向治疗。然而,由于目前对ESCC的发生发展机制认识不足,该疾病目前缺乏有效的靶向治疗方法。因此,进一步揭示ESCC发生的分子机制,探索参与其中的关键分子,寻找新的ESCC诊断标记物及药物治疗靶点是目前ESCC研究的关注热点。恶性 T 细胞扩增序列（Multiple copies in T-cell lymphoma-1,MCTS1）,是一种翻译重启释放因子,首次在淋巴瘤中作为癌基因被发现。MCTS1通过与DENR结合形成复合物,进一步与核糖体相互作用,影响蛋白质翻译重启。研究表明,MCTS1通过调控多种不同肿瘤相关蛋白的翻译过程,参与肿瘤的发生发展。此外,MCTS1能够通过MAPK信号通路、P53信号通路等促进肿瘤生长。已有研究报道,MCTS1在乳腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤以及非小细胞肺癌中均发挥促癌作用。肿瘤的生长需要细胞代谢改变来适应细胞快速扩张而不断增加的能量需求。著名的Warburg效应即指肿瘤细胞代谢流从线粒体氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation,OXPHOS）转变为糖酵解。而近年来研究发现,并不是所有类型的癌细胞都遵循这种模式。多种恶性肿瘤中OXPHOS水平高于正常组织,如白血病、淋巴瘤、胰管腺癌、高OXPHOS亚型黑色素瘤和子宫内膜癌等。以OXPHOS为靶点治疗OXPHOS上调的癌症亚型,已成为肿瘤靶向治疗的研究热点之一。而ESCC中OXPHOS如何变化尚未见报道。基于TCGA数据库的生信分析发现,MCTS1在ESCC高表达,且与不良预后正相关。据此,本研究旨在从分子、细胞、动物及组织水平全面揭示MCTS1对ESCC生长增殖的影响,并从OXPHOS为切入点,初步剖析MCTS1在ESCC中发挥功能的分子机制。研究内容主要分为以下三个部分:第一部分:利用TCGA数据库及收集的临床ESCC组织,分析MCTS1在ESCC组织中的表达和与预后相关性;并检测MCTS1在ESCC细胞株中的表达情况。第二部分:通过体外细胞实验探究MCTS1表达改变对ESCC细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响;并通过构建体内小鼠ESCC移植瘤模型,明确下调MCTS1对小鼠移植瘤生长的影响。第三部分:基于TCGA数据库,通过功能富集分析MCTS1的高表达和OXPHOS基因集表达的相关性,探究MCTS1表达改变对ESCC细胞OXPHOS的影响,及MCTS1对转录共激活因子PGC-1α表达的影响。方法第一部分:MCTS1在ESCC组织和细胞中的表达基于TCGA数据库分析MCTS1在ESCC中的表达及与预后相关性;免疫组化检测MCTS1在ESCC组织及癌旁正常组织中的表达差异;qRT-PCR、Western blot分别检测不同ESCC细胞株及食管正常上皮细胞Het-1A中MCTS1 mRNA和蛋白的表达水平。第二部分:MCTS1表达改变对ESCC生长增殖的影响1、选取2株ESCC细胞株,采用2对siRNA片段转染细胞,确定最佳转染浓度和时间,同时,构建MCTS1慢病毒干扰载体,均采用qRT-PCR和Western blot检测MCTS1干扰效率。通过CCK-8法、EdU染色法、平板克隆形成检测下调MCTS1对细胞存活及增殖能力的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染法检测下调MCTS1对细胞凋亡的影响;通过流式细胞术检测下调MCTS1对细胞周期的影响;采用Transwell、细胞划痕实验检测下调MCTS1对细胞迁移能力的影响;采用Western blot检测凋亡、周期、迁移及EMT相关蛋白表达的变化。2、构建MCTS1过表达重组质粒,转染ESCC细胞后,采用qRT-PCR和Western blot检测MCTS1过表达效率。随后利用CCK-8法、EdU以及Transwell法分别检测上调MCTS1对细胞增殖和迁移的影响。3、使用构建的稳转细胞株KYSE150,皮下注射构建裸鼠移植瘤模型,每隔1d测量裸鼠体重及移植瘤体积,14 d后处死裸鼠并剥离移植瘤,免疫组化法检测移植瘤中相关蛋白表达。第三部分:MCTS1对ESCC线粒体OXPHOS的调控作用1、采用GSEA分析MCTS1表达和OXPHOS功能基因集之间的表达相关性;2、基于TCGA数据库分析ESCC组织中OXPHOS相关基因表达变化;采用qRT-PCR和Western blot检测ESCC细胞株中线粒体OXPHOS相关基因的表达;3、检测ESCC细胞MCTS1表达改变后OXPHOS相关基因的表达情况;JC-1法检测线粒体膜电位,Western blot检测p-AMPK的蛋白表达;4、qRT-PCR、Western blot检测MCTS1表达改变后转录辅激活因子PGC-1α的表达变化。结果第一部分:MCTS1在ESCC组织及细胞中的表达基于TCGA数据库分析结果显示,MCTS1在ESCC中显著高表达,且其启动子区呈低甲基化,MCTS1的高表达和低甲基化均与预后不良显著相关;免疫组化结果显示,与癌旁正常组织相比,MCTS1在人ESCC组织中显著高表达;qRT-PCR和Western blot结果显示,除KYSE450细胞株外,MCTS1在其余几株ESCC细胞中的mRNA和蛋白的表达水平均显著高于在正常食管上皮细胞 Het-1A。第二部分:MCTS1表达改变对ESCC生长增殖的影响1、两种siRNA均能显著下调MCTS1在Eca109和KYSE150中的表达;MCTS1表达下调能够显著抑制Eca109和KYSE150细胞的存活、增殖、迁移及克隆形成能力,增加凋亡细胞比例,且引起G0/G1期细胞比例明显增加;抗凋亡蛋白Bcl-2、周期调控蛋白Cyclin D1、间充质标志物N-cadherin和Vimentin表达被抑制,促凋亡蛋白Bax和上皮标志物E-cadherin蛋白表达上调;2、过表达重组质粒转染后,MCTS1在Eca109和KYSE150细胞中的表达显著上调,MCTS1表达上调显著增加Eca109和KYSE150细胞的存活、增殖和迁移能力;3、裸鼠移植瘤实验显示,下调MCTS1明显抑制ESCC移植瘤的生长,移植瘤中Bcl-2及Ki67蛋白表达显著降低。第三部分:MCTS1对ESCC线粒体OXPHOS的调控作用1、GSEA分析结果显示,MCTS1高表达与OXPHOS基因集的表达呈正相关关系;2、基于TCGA数据库分析发现,OXPHOS基因集在ESCC中呈高表达,ESCC细胞株中线粒体OXPHOS相关基因的表达显著高于正常食管上皮细胞;3、MCTS1表达下调后,Eca109和KYSE150细胞内线粒体OXPHOS相关基因的表达普遍下降,细胞内线粒体膜电位下降、p-AMPK蛋白表达上升;MCTS1表达上调后则以上指标变化趋势相反。结果表明MCTS1能够增强细胞内OXPHOS活性。4、下调MCTS1能够降低ESCC细胞中转录辅激活因子PGC-1α的表达,上调MCTS1则使PGC-1α的表达升高。结论1、MCTS1在ESCC组织和细胞中高表达,且与患者不良预后正相关;2、MCTS1表达下调显著抑制ESCC细胞的增殖和迁移,阻滞细胞周期,并诱导细胞凋亡;MCTS1表达上调则明显促进ESCC细胞的增殖和迁移;且下调MCTS1能够抑制ESCC裸鼠移植瘤的生长;3、MCTS1可能通过调节线粒体OXPHOS促进ESCC的生长增殖。