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在根际对话(或互作)原理指导下,本文建立了以模式植物拟南芥种子萌发和根长为指标的“微生物次级代谢产物—植物根长抑制”筛选模型。以植物激素6—苄氨基嘌呤(6—BA)为阳性对照,蒸馏水为阴性对照,建立了拟南芥根长—琼脂混药评价方法,发现了由本实验室分离的抗生素丰加霉素(Toyocamycin)与6—BA相似,具有调节拟南芥根生长的活性。6—BA和丰加霉素抑制拟南芥根伸长50%所需的浓度(50%抑制浓度)分别为0.096mg/L和0.200mg/L,在相同浓度下,6—BA活性略高于丰加霉素。
为方便筛选,结合琼脂纸片扩散法优化了拟南芥根长抑制模型,建立了拟南芥根长—琼脂扩散筛选方法,并以云南药用植物根际土壤中分离到的682株放线菌发酵产物作为筛选对象,以期发现具有拟南芥根生长抑制活性的化合物。研究结果表明,682株根际放线菌中,25株菌的发酵液对拟南芥根生长具有不同程度的抑制作用,其中I06A-02110和106A-02381发酵液的乙酸乙酯提取物对拟南芥根生长具有较强的抑制作用。
对I06A-02381次级代谢产物的色谱及活性跟踪评价实验表明,在拟南芥模型上具有强抑制活性的组分含量极微,而具有弱活性且兼有抗枯草杆菌和稻瘟菌活性的化合物含量较大。对高含量,低活性成分进行色谱学分离,得到代号为2381的化合物。在254nm下,高效液相色谱分析表明纯度达100%。
化合物2381经紫外光谱,高分辨质谱,1H-NMR谱,13C-NMR谱,1H-1HCOSY谱,13C-1HCOSY谱,DEPT谱,HMBC谱解析证实化合物2381是已知抗生素七尾霉素A的甲酰化产物。
以DMSO和蒸馏水为阴性对照,6—BA为阳性对照,以琼脂混药评价方法,测定化合物2381对拟南芥根长的抑制活性,其50%抑制浓度大于1mg/L,经计算,其理论值为7.285mg/L,6—BA的50%抑制浓度为0.139mg/L,甲酰化的七尾霉素A具有极弱抑制拟南芥根生长的作用。
本课题在根际对话原理指导下,通过建立“微生物次级代谢产物—植物根长抑制”筛选模型,发现了植物根际放线菌阳性菌株,追踪到阳性菌株产生的活性组分,拓宽了根际放线菌的研究范围,为进一步从根际放线菌次级代谢产物中发现具有强植物调节活性的物质奠定了研究基础。
本文基于新种可能产生新化合物的假设,选取从新疆艾丁湖盐土中分离到的一株中度嗜盐放线菌I06A-01708作为研究对象。多相分类研究表明I06A-01708为多孢放线菌属新种(Actinopolysporanov.sp.),最适生长盐浓度为10%(w/v)NaCl,属于中度嗜盐放线菌。初步活性研究表明该菌的次级代谢产物对枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌(209P)和大肠杆菌(E.coli)均有抑制作用,其中对枯草芽孢杆菌的抑制活性最强,故选取枯草芽孢杆菌作为活性追踪的鉴定菌株。I06A-01708生长、发酵周期都很长,我们对其生长条件进行了优化,根据活性产物的产生时间确定了最佳发酵周期,同时对其次生代谢产物进行了研究。使用乙酸乙酯进行发酵液提取,通过硅胶柱层析,SephadexLH-20凝胶柱层析,薄层层析和高效液相色谱等分离方法,分离到一个分子量约为1110的化合物。它具有抑制枯草芽孢杆菌生长的活性,因其产量低,没有足够化合物进行进一步研究。发现了另一组化合物没有紫外吸收,但具有很强的抑制枯草芽孢杆菌活性,是次级代谢产物活性的主要成分。本文首次对多饱放线菌属新种(Actinopolysporanov.sp.)的次生代谢产物的分离纯化进行了试验,特别是对无紫外吸收化合物的分离进行了探索,初步确定其分离纯化的基本流程,进一步分离工作正在进行当中。