利用细菌作为药物载体治疗癌症已有上百年历史,但由于细菌本身的缺陷性和局限性,造成对癌症的治疗进展十分缓慢。随着现代微生物基因工程技术的发展,给我们带来了新的曙光。MAP30是一种分子量为30 kDa的抗肿瘤蛋白,该种蛋白是从成熟的苦瓜种子和果实中发现和分离得到的。该类蛋白属于单链I型核糖体失活蛋白(ribosome inhibiting protein,RIP)家族,普遍存在于高等植物中,因可使真核细胞的核糖体失活而得名,具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等多种生物学活性。本研究从苦瓜基因组中PCR扩增去前导肽后的成熟MAP30蛋白基因,克隆至可诱导表达载体pET28a中。将含map30基因的表达载体pET28a-map30转化至E.coli Rostta(DE3)中并通过IPTG诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白杂交(Western Blot)以及液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对表达的重组MAP30蛋白进行鉴定,并通过镍柱亲和层析纯化重组MAP30蛋白。将pUC19质粒与不同浓度纯化后的重组MAP30蛋白进行孵育,分析其切割DNA的活性。同时体外作用于人乳腺癌细胞(MCF-7),采用MTT、DNA Ladder、AO/PI双染等方法检测该重组蛋白的抗肿瘤活性。结果显示,MAP30蛋白可以在E.coli Rostta(DE3)中诱导表达,经质谱鉴定和Western Blot分析表明目的MAP30蛋白成功与His-tag融合表达。首次发现异源表达的重组MAP30蛋白同天然蛋白一样具有使超螺旋DNA断裂为缺口环状及线状DNA的活性。MTT细胞毒性实验结果表明,重组MAP30蛋白能明显抑制MCF-7细胞的增殖和生长,且抑制作用呈浓度和时间依赖性,DNALadder,AO/PI双染结果呈现明显的凋亡现象。同时以抗肿瘤药物5-Fu、β-Elemene为对照,经Giemsa染色及激光共聚焦显微镜(confocal)观察到MAP30蛋白作用MCF-7细胞后不同的亚细胞结构变化。基于以上研究基础,进一步通过Red/ET同源重组技术将map30基因插入到低氧启动子后,构建含map30的低氧表达载体,并电转入宿主菌E.coli Nissle 1917。本文鉴定了来源于苦瓜的MAP30蛋白的抗肿瘤活性,这为进一步研究MAP30蛋白的抗肿瘤分子机制提供了理论基础。同时构建了可在低氧环境中诱导MAP30蛋白表达的抗肿瘤靶向工程菌E.coli Nissle 1917(pET28a-Pvhb-pelb-map30),这为远程遥控工程菌在抗肿瘤药物表达方面奠定了基础,也进一步证实Red/ET同源重组技术在分子克隆方面的优越性。