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目的：
本文通过对预针刺不同配穴（合募配穴和俞募配穴），研究其对应激性胃溃疡（SGU）大鼠胃黏膜形态的影响和对血清及胃组织中氧化-抗氧化与炎症相关因子的影响，以及对胃组织TLRs信号通路及大肠组织TLRs信号通路相关mRNA的影响，从多角度分析不同配穴对应激性胃溃疡大鼠黏膜组织的保护作用。探讨预针刺不同配穴对保护黏膜组织作用上的效应差异，以期对腧穴配伍理论提供实验依据。
方法：
1.将36只雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组，模型组，合募配穴组和俞募配穴组，每组9只，合募配穴组予以电针“中脘”—“足三里”，10min/次，隔日1次，俞募配穴组予以电针“中脘”—“胃俞”，10min/次，隔日1次，两组均干预10天。随后采用水浸束缚应激法建立SGU大鼠模型。采用肉眼及苏木精-伊红染色观察各组大鼠的胃黏膜形态、计算溃疡指数（UI）和病变积分。以观察不同配穴对胃黏膜组织的保护作用。
2.采用TBA法测定血清中SOD、MDA水平，比色法测定血清及胃组织MPO、血清GSH-Px水平，硝酸还原酶法测定血清及胃组织NO水平，采用ELISA法测定血清中ET-1、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。以检测血清及胃组织中氧化-抗氧化及炎症因子的水平。
3.采用免疫组化染色法观察胃组织TLR4、MyD88、TRIF蛋白表达情况。采用Western blot法检测胃组织中TLR4、MyD88、IκB-α蛋白的表达。以观察不同配穴对TLR4信号通路的调节作用。
4.采用FastQC测序数据，对原始数据质量评估；采用Trim galore测序数据并进行质量控制；采用HISAT2参考基因组比对；采用Rseqc对转录组整体质量评估；采用String Tie进行基因表达定量；采用deseq2进行差异基因鉴定；采用WGCNA进行WGCNA分析；采用ClusterProfiler进行富集分析（GO富集分析、KEGG富集分析），以检测大鼠大肠组织TLRs信号通路相关mRNA表达情况。
结果：
1.通过观察胃组织肉眼及胃溃疡组织形态学的变化，同时结合UI及病变积分，发现预针刺合募配穴与俞募配穴均具有保护SGU大鼠胃黏膜的作用，与模型组相比UI及病变积分，具有显著性差异（P＜0.0001），合募配穴组与俞募配穴比较UI上无显著性差异（P＞0.05），从病变积分上来看，合募配穴组的效果优于俞募配穴组(P＜0.05)。说明从病理组织切片中观察合募配穴对胃黏膜的保护作用优于俞募配穴组。
2.预针刺合募配穴组与俞募配穴组能有效预防当SGU发生时氧化-抗氧化因子紊乱状态，胃组织中，模型组与空白组比较MPO(P＜0.001)，NO（P＜0.05）水平显著上升，俞募配穴组与模型组比较MPO显著下降(P＜0.001)，合募配穴组与模型组比较下降不显著（P＞0.05），说明俞募配穴具有降低MPO水平的作用。合募配穴组与模型组比较NO显著下降（P＜0.05），俞募配穴组与模型组比较，NO上升但不显著（P＞0.05）。说明胃组织中合募配穴可显著降低NO的水平。
3.模型组与空白组比较，血清中SOD（P＜0.0001），NO（P＜0.001），GSH-Px（P＜0.001）水平显著下降，MPO（P＜0.0001）、MDA（P＜0.0001）、ET-1（P＜0.001）水平显著上升，俞募配穴组、合募配穴组与模型组比较，血清中MPO（P＜0.05），MDA（P＜0.001），ET-1（P＜0.001）水平显著下降，说明合募配穴组与俞募配穴组在调节血清MPO、MDA、ET-1水平上具有共同点。合募配穴组与模型组比较SOD（P＜0.0001），NO（P＜0.001），GSH-Px（P＜0.0001）水平显著上升。俞募配穴组与模型组比较SOD（P＜0.05），NO（P＜0.001）水平显著上升。合募配穴与俞募配穴组比较SOD（P＜0.05），GSH-Px（P＜0.001）水平显著上升。说明合募配穴组与俞募配穴组比较不同点在于SOD、GSH-Px水平上。
4.模型组与空白组相比，IL-6（P＜0.0001），TNF-α（P＜0.0001），IL-1β（P＜0.001）含量显著升高，合募配穴组与模型组比较，预针刺处理大鼠后IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.0001），但IL-1β含量之间并没有显著性差异（P＞0.05），俞募配穴组与模型组比较，预针刺处理大鼠后IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.0001），IL-1β（P＜0.001）含量亦显著下降，说明俞募配穴组与合募配穴组比较不同点在于调节IL-1β含量上。
5.与空白组相比，模型组显著提高了TLR4和MyD88，TRIF的表达（P＜0.05），降低IκB-α的表达（P＜0.05），合募配穴组与俞募配穴组预处理显著降低了TLR4、MyD88和TRIF的表达（P＜0.05），提高了IκB-α的表达（P＜0.05），这表明预针刺合募配穴与俞募配穴可抑制TLR4/MyD88/TRIF/IκB信号通路的激活而发挥保护胃黏膜组织的作用。其不同点在于MyD88蛋白表达量上。
6.在KEGG富集中，富集到的TLR信号通路是Toll-like receptor signaling pathway。空白组与模型组比较应激性胃溃疡发生时改变的关键相关基因有Casp8，Nfkbia，Tlr4，Ctsk，Cxcl10，Spp1，Cxcl11，Irf7，Traf6；在GO富集中，合募配穴组与俞募配穴组保护黏膜组织的基因共同的有1个，为Cd36，俞募配穴与合募配穴预防黏膜组织的不同的关键基因有Tlr1，S100a9，Reg3g，Lbp，Tnf，Tlr5，Nod2。
结论：
1预针刺对SGU大鼠的氧化应激及炎症因子水平有调整作用，这可能是“调衡防控”的重要起始步骤之一。其中，不同配穴效应差异的关键因子可能是SOD、GSH-Px、MPO、IL-1β。
2预针刺对SGU大鼠黏膜组织的保护作用可能是通过TLRs信号通路转导实现的。这可能是“调衡防控”的中心环节之一。合募配穴可能通过抑制TLR1/TLR4/MyD88/TRIF/IκB-α通路而发挥作用，俞募配穴可能通过抑制TLR4/TLR5/MyD88/TRIF/IκB-α通路而发挥作用，其不同点可能在于TLR1、TLR5、MyD88蛋白上。
本文通过对预针刺不同配穴（合募配穴和俞募配穴），研究其对应激性胃溃疡（SGU）大鼠胃黏膜形态的影响和对血清及胃组织中氧化-抗氧化与炎症相关因子的影响，以及对胃组织TLRs信号通路及大肠组织TLRs信号通路相关mRNA的影响，从多角度分析不同配穴对应激性胃溃疡大鼠黏膜组织的保护作用。探讨预针刺不同配穴对保护黏膜组织作用上的效应差异，以期对腧穴配伍理论提供实验依据。
方法：
1.将36只雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组，模型组，合募配穴组和俞募配穴组，每组9只，合募配穴组予以电针“中脘”—“足三里”，10min/次，隔日1次，俞募配穴组予以电针“中脘”—“胃俞”，10min/次，隔日1次，两组均干预10天。随后采用水浸束缚应激法建立SGU大鼠模型。采用肉眼及苏木精-伊红染色观察各组大鼠的胃黏膜形态、计算溃疡指数（UI）和病变积分。以观察不同配穴对胃黏膜组织的保护作用。
2.采用TBA法测定血清中SOD、MDA水平，比色法测定血清及胃组织MPO、血清GSH-Px水平，硝酸还原酶法测定血清及胃组织NO水平，采用ELISA法测定血清中ET-1、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。以检测血清及胃组织中氧化-抗氧化及炎症因子的水平。
3.采用免疫组化染色法观察胃组织TLR4、MyD88、TRIF蛋白表达情况。采用Western blot法检测胃组织中TLR4、MyD88、IκB-α蛋白的表达。以观察不同配穴对TLR4信号通路的调节作用。
4.采用FastQC测序数据，对原始数据质量评估；采用Trim galore测序数据并进行质量控制；采用HISAT2参考基因组比对；采用Rseqc对转录组整体质量评估；采用String Tie进行基因表达定量；采用deseq2进行差异基因鉴定；采用WGCNA进行WGCNA分析；采用ClusterProfiler进行富集分析（GO富集分析、KEGG富集分析），以检测大鼠大肠组织TLRs信号通路相关mRNA表达情况。
结果：
1.通过观察胃组织肉眼及胃溃疡组织形态学的变化，同时结合UI及病变积分，发现预针刺合募配穴与俞募配穴均具有保护SGU大鼠胃黏膜的作用，与模型组相比UI及病变积分，具有显著性差异（P＜0.0001），合募配穴组与俞募配穴比较UI上无显著性差异（P＞0.05），从病变积分上来看，合募配穴组的效果优于俞募配穴组(P＜0.05)。说明从病理组织切片中观察合募配穴对胃黏膜的保护作用优于俞募配穴组。
2.预针刺合募配穴组与俞募配穴组能有效预防当SGU发生时氧化-抗氧化因子紊乱状态，胃组织中，模型组与空白组比较MPO(P＜0.001)，NO（P＜0.05）水平显著上升，俞募配穴组与模型组比较MPO显著下降(P＜0.001)，合募配穴组与模型组比较下降不显著（P＞0.05），说明俞募配穴具有降低MPO水平的作用。合募配穴组与模型组比较NO显著下降（P＜0.05），俞募配穴组与模型组比较，NO上升但不显著（P＞0.05）。说明胃组织中合募配穴可显著降低NO的水平。
3.模型组与空白组比较，血清中SOD（P＜0.0001），NO（P＜0.001），GSH-Px（P＜0.001）水平显著下降，MPO（P＜0.0001）、MDA（P＜0.0001）、ET-1（P＜0.001）水平显著上升，俞募配穴组、合募配穴组与模型组比较，血清中MPO（P＜0.05），MDA（P＜0.001），ET-1（P＜0.001）水平显著下降，说明合募配穴组与俞募配穴组在调节血清MPO、MDA、ET-1水平上具有共同点。合募配穴组与模型组比较SOD（P＜0.0001），NO（P＜0.001），GSH-Px（P＜0.0001）水平显著上升。俞募配穴组与模型组比较SOD（P＜0.05），NO（P＜0.001）水平显著上升。合募配穴与俞募配穴组比较SOD（P＜0.05），GSH-Px（P＜0.001）水平显著上升。说明合募配穴组与俞募配穴组比较不同点在于SOD、GSH-Px水平上。
4.模型组与空白组相比，IL-6（P＜0.0001），TNF-α（P＜0.0001），IL-1β（P＜0.001）含量显著升高，合募配穴组与模型组比较，预针刺处理大鼠后IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.0001），但IL-1β含量之间并没有显著性差异（P＞0.05），俞募配穴组与模型组比较，预针刺处理大鼠后IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.0001），IL-1β（P＜0.001）含量亦显著下降，说明俞募配穴组与合募配穴组比较不同点在于调节IL-1β含量上。
5.与空白组相比，模型组显著提高了TLR4和MyD88，TRIF的表达（P＜0.05），降低IκB-α的表达（P＜0.05），合募配穴组与俞募配穴组预处理显著降低了TLR4、MyD88和TRIF的表达（P＜0.05），提高了IκB-α的表达（P＜0.05），这表明预针刺合募配穴与俞募配穴可抑制TLR4/MyD88/TRIF/IκB信号通路的激活而发挥保护胃黏膜组织的作用。其不同点在于MyD88蛋白表达量上。
6.在KEGG富集中，富集到的TLR信号通路是Toll-like receptor signaling pathway。空白组与模型组比较应激性胃溃疡发生时改变的关键相关基因有Casp8，Nfkbia，Tlr4，Ctsk，Cxcl10，Spp1，Cxcl11，Irf7，Traf6；在GO富集中，合募配穴组与俞募配穴组保护黏膜组织的基因共同的有1个，为Cd36，俞募配穴与合募配穴预防黏膜组织的不同的关键基因有Tlr1，S100a9，Reg3g，Lbp，Tnf，Tlr5，Nod2。
结论：
1预针刺对SGU大鼠的氧化应激及炎症因子水平有调整作用，这可能是“调衡防控”的重要起始步骤之一。其中，不同配穴效应差异的关键因子可能是SOD、GSH-Px、MPO、IL-1β。
2预针刺对SGU大鼠黏膜组织的保护作用可能是通过TLRs信号通路转导实现的。这可能是“调衡防控”的中心环节之一。合募配穴可能通过抑制TLR1/TLR4/MyD88/TRIF/IκB-α通路而发挥作用，俞募配穴可能通过抑制TLR4/TLR5/MyD88/TRIF/IκB-α通路而发挥作用，其不同点可能在于TLR1、TLR5、MyD88蛋白上。