论文部分内容阅读
人类复杂性状疾病是当前研究的热点与难点。糖尿病、早老性痴呆、癌症和精神分裂症等疾病的遗传机理及相关效应基因仍未最终揭晓。分析候选基因的表达量是复杂性疾病研究的重要步骤。目前,分析候选基因表达量的常用技术有全基因组表达芯片及实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)等定量技术,前者最大优点在于其高通量,能同时并行分析上千上万种分子,但定量准确度较低,而它极高的成本也限制了其推广应用。实时定量PCR技术具有Northern blot等技术所不具有的定量分析能力,如稳定性好、灵敏度高等优势,但同时它也存在检测通量小、样本处理费时费力成本高等缺点。因此一种中通量、成本低的基因表达平台亟待开发。本文建立一种基于通用荧光引物的多重竞争性PCR技术。该技术通过制备样本的内对照,采用嵌合特异引物引导荧光通用引物的扩增方案完成整个PCR反应,PCR反应被分两个阶段进行。前20个循环,主要是嵌合特异引物引导cDNA模板进行扩增,后面15个循环主要是通用荧光引物完成整个PCR反应。PCR产物经ABI3730型测序仪分离检测并获取峰值。通过比较对照样本和待测样本标化后的峰值,来检测待测样本目标区段基因的表达量。该技术实现了简便,经济可靠的中通量基因表达定量研究,弥补了cDNA芯片定量准确性低、实时定量PCR通量小等缺点,完善了整个基因表达量的分析过程。本文以C3H/He J和C57BL/6J两个近交系品系18日龄小鼠的下丘脑组织为研究对象,在小家鼠X染色体上与性发育启动相关的数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)(Chr X:DXMit68-rs29053133)区段内选择10个候选基因,并引入一个看家基因HPRT1进行数据的标化,应用竞争性PCR技术,建立基于荧光通用引物竞争性PCR方案。实验结果显示,在下丘脑中,选取的10个目的基因在两种品系老鼠中的表达量并无差异。通过本实验,我们建立与优化了一种多重定量基因表达技术,通过该技术排除了X染色体(性染色体)存在参与性发育启动相关通路的10个候选基因。同时,本文结合实时定量PCR技术进行验证,两者结果一致。这些工作验证了基于荧光通用引物竞争性PCR定量技术的准确性以及可靠性,为以后性发育候选基因的分析提供了基础。