背景:对于白内障病因学的分子生物学机制,目前存在多种学说,包括氧自由基氧化损伤、线粒体途径介导凋亡、内质网超载、钙离子失衡、晶状体上皮细胞凋亡、UVA/UVB损伤或基因突变、晶状体蛋白或调节基因突变、局部内稳态失衡等等。尽管各种学说都基于确切的实验依据,但大多数研究都认为,晶状体上皮细胞（lensepithelialcells,LECs）结构和功能的改变,以及基于这种改变所引起的细胞损伤、胀亡、凋亡、副凋亡才是白内障发生、发展的分子学基础。因此,探讨LECs生理生化及代谢方面的改变,深入揭示晶状体上皮细胞凋亡的分子生物学机制,有助于发现白内障发生发展的原因,同时进一步研究如何对晶状体上皮细胞损伤及凋亡进行干预,也是研究白内障药物防治的一个新的突破口。细胞凋亡（apoptosis）是一种由细胞自我发起、受到自我调节的程序性死亡方式。Smac是一种促进线粒体途径细胞凋亡的调节因子,在细胞凋亡的诱导和调控阶段具有重要的作用。在细胞中,内质网（endoplasmic reticulum,ER）负责大部分蛋白的合成、折叠、翻译后修饰和转运,而且与钙离子储存和释放有关。当细胞外界环境发生改变或者机体处于病理状态下,如氧化损伤、缺血、缺氧、血糖异常、钙离子浓度异常和病毒感染等,都会干扰内质网内稳态,导致蛋白质折叠异常,使得未折叠/错误折叠蛋白在内质网腔内大量堆积,如果这种蛋白堆积过多,内质网不能代偿,将激活细胞内特定的信号传导通路——未折叠蛋白应答（unfolded protein response,UPR）,这个过程即称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。UPR早期目的是努力维持和恢复内质网内稳态,蛋白质翻译速度降低、ER相关错误蛋白降解途径激活、表达伴侣蛋白使蛋白质折叠能力增强、未折叠蛋白或错误折叠蛋白生成减少,恢复ER内稳态。但当ERS过于强烈或持久,ER始终不能恢复内稳态时,UPR将介导细胞发生凋亡。在ERS过程中,有三种ER应激感受器,对应三条经典的已知信号通路,分别是:肌醇必需酶（IRE1）,PKR类似的内质网激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）,这三条信号通路协同完成了UPR的过程。内质网应激状态一方面通过促进蛋白折叠对细胞起保护作用,另一方面通过介导凋亡将机体内部内稳态完全失衡的细胞清除。因此,维持内质网的适度应激,是细胞存活的关键。为了研究年龄相关性白内障的发生与Smac及内质网应激之间的关系,我们以最经典的肌醇必需酶（IRE1）为代表进行了预实验,取年龄相关性白内障患者及正常人LECs,以GAPDH为内参,进行RT-PCR,检测Smac、内质网应激标志性蛋白GRP78、Caspase-12在晶状体上皮细胞的表达情况,结果显示其在年龄相关性白内障患者LECs中较透明晶状体LECs中同步上调,免疫组化显示:在年龄相关性白内障患者LECs中Smac、GRP78、Caspase-12均为阳性,正常人LECs中均为阴性。我们推测,在白内障发生、发展的过程中,Smac和内质网应激都起到了非常重要的作用,Smac与内质网应激及细胞凋亡间存在着某种尚不可知的关系,这两者之间的关系以及具体的作用途径和作用机制,目前国内外文献尚未见相关报道。本研究共分为三部分:第一部分:取白内障患者晶状体前囊片和正常的透明晶状体前囊片,对比两组之间Smac及ERS相关标志蛋白和下游蛋白的表达的差异。第二部分:通过构建Smac基因过表达及下调慢病毒载体,体外转染人晶状体上皮细胞,人为调控Smac在人晶状体上皮细胞中的表达,并观察调控后对人晶状体上皮细胞增殖的影响,筛选并构建稳定表达的人Smac基因过表达及下调人晶状体上皮细胞系。第三部分:以稳定的Smac过表达及下调人晶状体上皮细胞系为模型,筛选合适的H₂O₂浓度构建氧化应激诱导的内质网应激模型,研究Smac过表达及下调对人晶状体上皮细胞增殖、内质网应激过程及其介导的细胞凋亡的影响,并根据相关蛋白表达的差异,利用免疫共沉淀及质谱分析,寻找其中可能存在的桥梁蛋白及其可能的作用途径和作用机制。第一部分Smac与内质网应激相关蛋白在白内障及正常人晶状体上皮细胞内表达的差异目的:观察白内障患者晶状体前囊片和正常的透明晶状体前囊片Smac及ERS相关标志蛋白和下游蛋白的表达差异。方法:白内障晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月来我院眼科中心行Phaco+IOL植入术的单纯老年性白内障患者33例（50眼）,手术均由同一位手术经验丰富的教授完成。30例透明晶状体前囊片及上皮细胞均来源于2014年1月至2014年12月于我院及外院行角膜移植捐献者。免疫组化半定量分级检测两组间Smac、Cyt-c、JNK、Caspase-9、GRP78、GRP94、Caspase-12、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4表达差异。结果:免疫组化结果显示:正常人晶状体上皮细胞除Cyt-c、GRP94表达为强阳性至阳性;Caspase-9、Caspase-12表达为弱阳性之外,余蛋白完全没有阳性着色,均不表达。白内障患者晶状体上皮细胞中,Smac、JNK、GRP78、CHOP、ATF4、Cyt-c、GRP94表达从阳性至强阳性不等,Caspase-9、Caspase-12表达为阳性,XBP1、GADD34表达从弱阳性至阳性不等。对比后可以发现,Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4这几种蛋白在白内障患者LECs中表达,在正常人LECs中不表达,这一结果表明Smac及ERS相关蛋白的表达与白内障的发生和发展具有相关性。1.Smac、JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4在白内障患者LECs中表达,在正常人LECs中不表达。2.Caspase-12与Caspase-9在白内障患者LECs细胞浆内高表达,在正常人LECs细胞浆内仅少量表达。3.Smac及JNK、GRP78、CHOP、XBP1、GADD34、ATF4、Caspase-12、Caspase-9的表达与白内障的发生和发展具有相关性。第二部分Smac基因过表达及干扰慢病毒载体构建及体外转染HLE-B3的实验研究目的:构建Smac基因过表达及下调表达载体,进行慢病毒包装,体外转染HLE-B3进行表达,观察Smac的过表达及下调对HLE-B3增殖的影响,根据Smac表达情况及细胞增殖情况,筛选出稳定表达的Smac基因过表达及下调表达细胞系。CCK-8检测载体的细胞毒性;Western blot检测转染后各组中及传代后细胞中Smac及ERS相关蛋白的表达水平。嘌呤霉素筛选转染阳性细胞。方法:1.慢病毒介导的Smac基因过表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含NheI和NotI酶切位点的上下游引物,PCR扩增。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。2.慢病毒介导的Smac基因干扰表达载体的构建以cDNA-Smac为模板,设计含Age1和EcoR1酶切位点的上下游引物,PCR扩增。载体pLenti-hU6-Puro双酶切后和扩增的目的基因以无缝克隆重组。转化感受态细菌后挑选正确的克隆酶切、PCR及测序鉴定。共同转染HEK 293TF细胞,包装慢病毒,72h后收获病毒原液,离心过滤,超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液,梯度法测定病毒滴度。3.配制浓度分别为2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml和10.0μg/ml的嘌呤霉素筛选转染细胞。4.2种慢病毒分别转染HLE-B3细胞72h后,CCK-8检测空白对照组、空载体转染组和Smac过表达及干扰表达慢病毒载体转染组细胞的存活率。5.QPCR检测空白对照组、空载体转染组和Smac过表达及干扰表达慢病毒载体转染组Smac mRNA水平。6.Western blot检测空白对照组、空载体转染组和Smac过表达及干扰表达慢病毒载体转染组Smac蛋白的表达水平。7.Western blot检测嘌呤霉素筛选阳性细胞传代后,细胞中Smac蛋白的表达水平。结果:1.经酶切和测序鉴定Smac慢病毒表达载体序列正确。HEK 293TF细胞包装后获得了病毒储存液,GTP-SMAC过表达载体病毒的滴度为4×10⁸TU/ml:PM7.1-SMAC-sh1、PM7.1-SMAC-sh2、PM7.1-SMAC-sh3病毒的滴度分别为3×10⁸TU/ml、2×10⁸TU/ml、2×10⁸TU/ml。2.筛选2天后,8μg/ml嘌呤霉素组未转染成功的细胞刚好全部死亡,为最佳筛选浓度。3.CCK-8检测,空白对照细胞组HLE-B3、Smac过表达空载质粒组GTP、Smac过表达细胞组GTP-SMAC、Smac干扰空载质粒组PM7.1、Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh1,PM7.1-SMAC-sh2和PM7.1-SMAC-sh3组的细胞存活率分别为（99.56±5.12）%、（98.61±4.22）%、（93.96±2.75）%、（97.86±3.97）%、（99.12±6.34）%、（102.78±4.56）%、（104.56±5.12）%,差异无统计学意义（F=34.564,P=0.131）;其中,GTP和PM7.1与HLE-B3组间两两比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;GTP-SMAC组与Smac干扰表达的三组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;其余各组间两两比较,差异均无统计学差异;Smac干扰表达的三组之间,以及与HLE-B3、GTP和PM7.1组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。4.QPCR检测mRNA水平:各组Smac mRNA的相对表达量分别为:HLE-B3组（1.073±0.0746）、GTP组（1.062±0.0938）、GTP-SMAC组（4.236±0.108）、PM7.1组（1.073±0.121）、PM7.1-SMAC-sh1组（0.962±0.078）,PM7.1-SMAC-sh2组（0.514±0.121）和PM7.1-SMAC-sh3组（0.173±0.0451）;GTP-SMAC组Smac mRNA明显上调,PM7.1-SMAC-sh2、PM7.1-SMAC-sh3组Smac mRNA明显下调,与HEL-B3组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;PM7.1-SMAC-sh1组Smac mRNA与HEL-B3组相比,差异无统计学意义（P>0.05）;PM7.1-SMAC-sh3组Smac mRNA表达量低于PM7.1-SMAC-sh2组,差异有统计学意义（P<0.05）。5.Western blot结果显示,各组Smac蛋白表达量分别为:HLE-B3组（0.521±0.059）、GTP组（0.594±0.148）、GTP-SMAC组（2.580±0.255）、PM7.1组（0.608±0.058）、PM7.1-SMAC-sh1组（0.568±0.106）,PM7.1-SMAC-sh2组（0.306±0.0471）和PM7.1-SMAC-sh3组（0.196±0.126）;7组总体比较,差异有统计学意义（P<0.05）;其中HEL-B3组、GTP组、PM7.1组、PM7.1-SMAC-sh1组这四组之间比较,差异无统计学意义（P>0.05）;GTP-SMAC组较HEL-B3组,Smac表达量显著提高（P<0.05）;而PM7.1-SMAC-sh2组、PM7.1-SMAC-sh3组与HEL-B3组比较,Smac表达量显著降低（P<0.05）,以PM7.1-SMAC-sh3组降低更为明显,与PM7.1-SMAC-sh2组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,结合QPCR结果,确定Smac干扰表达采用PM7.1-SMAC-sh3组。6.正常对照组、Smac过表达嘌呤霉素筛选组、Smac过表达筛选传代组、Smac干扰嘌呤霉素筛选组、Smac干扰筛选传代组,Smac蛋白的相对表达量分别为（0.743±0.231）、（2.580±0.896）、（2.877±0.759）、（0.216±0.556）、（0.226±0.187）。总体比较,差异有统计学意义（F=3126,P=0.001）;Smac过表达嘌呤霉素筛选组与Smac过表达筛选传代组组间比较,差异无统计学意义（P=0.975）;Smac干扰嘌呤霉素筛选细胞组与Smac干扰筛选传代组组间比较,差异无统计学意义（P=0.854）;余两两比较,差异均有统计学意义（P=0.001）。结论:1.成功构建Smac过表达和干扰慢病毒表达载体。2.慢病毒转染对HLE-B3无细胞毒性。3.下调Smac表达与Smac过表达相比,对HLE-B3的增殖有促进作用。4.慢病毒转染外源性基因后,Smac蛋白可在HLE-B3中稳定高效的过表达及下调表达。第三部分Smac基因过表达及干扰对HLE-B3内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响及作用机制目的:以稳定的Smac过表达及下调晶状体上皮细胞系为模型,筛选合适的H₂O₂浓度构建氧化应激模型,探讨Smac基因过表达及干扰对HLE-B3增殖、内质网应激及其介导的细胞凋亡的影响,并根据相关蛋白表达的差异,利用免疫共沉淀及质谱分析,寻找其中可能存在的桥梁蛋白及其可能的作用途径和作用机制。方法:1.加入H₂O₂后以CCK-8检测各组细胞的存活率,根据实验结果,选择200μM的H₂O₂作为实验浓度。2.细胞根据处理因素的不同分为两个大组:第一大组为无H₂O₂处理组,分为:空白对照细胞组HLE-B3、Smac过表达空载质粒组GTP、Smac过表达细胞组GTP-SMAC、Smac干扰空载质粒组PM7.1、Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组;第二大组为H₂O₂处理组,分为:H₂O₂处理空白对照细胞组HLE-B3、H₂O₂处理Smac过表达空载质粒组GTP、H₂O₂处理Smac过表达细胞组GTP-SMAC、H₂O₂处理Smac干扰空载质粒组PM7.1、H₂O₂处理Smac干扰细胞组PM7.1-SMAC-sh3组。3.MTT法检测各组细胞抑制作用,CCK-8检测各组细胞的增殖情况,RT-PCR检测Smac、ATF4、Caspase-12、CHOP、GRP78、JNK mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞Smac、ATF4、Caspase-12、CHOP、GRP78、JNK蛋白的表达水平。免疫共沉淀寻找Smac与ERS相关蛋白,对结果进行质谱分析。结果:1.MTT结果显示:不同浓度的H₂O₂对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,呈剂量依赖关系,半数抑制浓度（IC50）为270μM,高浓度（1000pM）H₂O₂处理24h时见细胞几乎全部死亡,不同浓度的H₂O₂对HLE-B3细胞有不同程度的抑制作用,并呈剂量依赖关系。由于外源H₂O₂改变了细胞原有的大小和形态,且本实验同时对Smac进行过表达和下调,因此将浓度为200μM的H₂O₂作为推荐剂量构建体外氧化损伤模型。2.CCK-8结果显示:无H₂O₂作用时,HLE-B3组、GTP组、GTP-SMAC组、PM7.1组、PM7.1-SMAC-sh3组的存活率分别为（99.56±5.12）%、（98.61±4.22）%、（93.96±2.75）%、（97.86±3.97）%、（104.56±5.12）%,统计学结果与第二部分相同;加入200μM的H₂O₂后,5组存活率分别为（59.339±4.895）%、（63.943±5.125）%、（39.960±3.683）%、（61.193±33.065）%、（90.560±3.574）%。组间比较,差异有统计学意义（F=57.06,P<0.001）;200μM H₂O₂+GTP-SMAC组细胞存活率低于正常细胞组,差异有统计学意义（P=0.001）;200μM H₂O₂+PM7.1-SMAC-sh3组细胞存活率高于正常细胞组和GTP-SMAC组,差异均有统计学意义（P=0.001）;200μM H₂O₂+HLE-B3组、200μM H₂O₂+GTP组、200μM H₂O₂+PM7.1组之间比较无统计学差异（P>0.05）。3.RT-PCR法检测:无H₂O₂处理时,Smac、ATF4、GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA在GTP-SMAC组高表达,与HLE-B3组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;Smac、ATF4、GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA在PM7.1-SMAC-sh3组下调表达,与HLE-B3组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;各mRNA在HLE-B3组、GTP组、PM7.1组,组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）;JNK mRNA表达,各组间无统计学差异（P>0.05）。H₂O₂处理后Smac、ATF4、GRP78、Caspase-12、CHOP mRNA在200μM H₂O₂+GTP-SMAC组中高表达,Smac、ATF4、Caspase-12 mRNA在200μM H₂O₂+PM7.1-SMAC-sh3组中表达下调,分别与200μM H₂O₂+HLE-B3组两两比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;各mRNA在200μM H₂O₂+HLE-B3组、200μM H₂O₂+GTP组、200μM H₂O₂+PM7.1组,组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）;JNK mRNA在各组间表达无统计学意义（P>0.05）。4.Westen-blot检测:无H₂O₂处理时,Smac、ATF4、CHOP、GRP78在GTP-SMAC组高表达,Smac、ATF4、CHOP、在PM7.1-SMAC-sh3组下调表达,与HLE-B3组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;JNK表达组间无明显差异（P>0.05）,其余各蛋白在各组间,差异有统计学意义（P<0.05）;各蛋白表达在HLE-B3组、GTP组、PM7.1组,组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。H₂O₂处理后,Smac、ATF4、Caspase-12、CHOP、GRP78、JNK在200μM H₂O₂+GTP-SMAC组高表达,在200μM H₂O₂+PM7.1-SMAC-sh3组下调表达,与200μM H₂O₂+HLE-B3组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;各蛋白表达在200μM H₂O₂+HLE-B3组、200μM H₂O₂+GTP组、200μM H₂O₂+PM7.1组,组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。5.免疫共沉淀、质谱分析:得到的CO-IP拉下的蛋白为:CCDC171、TSNARE1、LRRC29、cadherin-23、PDE1C、IGFBP5、MELTF、NDUFS4。结论:1.Smac过表达或下调,对正常状态下的HLE-B3增殖率无影响;Smac过表达会加剧氧化应激下的HLE-B3凋亡,Smac下调对氧化应激下的HLE-B3凋亡起保护作用。2.正常状态下的HLE-B3,Smac过表达后能通过上调内质网应激相关蛋白的表达,加剧内质网应激,加重HLE-B3凋亡;而Smac下调后能够抑制内质网应激相关蛋白,对细胞的氧化损伤具有一定的保护作用,减少HLE-B3的凋亡。3.HLE-B3氧化损伤后,Smac过表达能通过上调内质网应激途径的效应蛋白来加剧内质网介导的细胞凋亡;Smac下调能通过下调内质网应激途径的凋亡相关蛋白,来抑制内质网途径介导的细胞凋亡。4.PDE1C、IGFBP5可能是Smac与ERS间的桥梁蛋白。