嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),是引起淡水鱼败血症的主要病原,也可引起人类感染发病,是一种人-畜-鱼共患的致病微生物。该菌致病机制复杂,迄今为止还有许多未知毒力因子尚未发现。全面鉴定嗜水气单胞菌毒力基因将有助于人们对该病原菌的分子致病机制有更加深入的认识,为控制和预防该菌引发的传染病的发生提供更多手段和途径。然而,目前嗜水气单胞菌中国分离株尚未进行全基因组测序,无法全面破译其遗传信息,并且缺乏合适的毒力评估模型,这些都限制了该菌致病机制的研究。本研究对嗜水气单胞菌中国流行株进行了全基因组测序分析,鉴定出流行株所特有的3条代谢途径,确定了 ST251型菌株为中国和美国地区的主要流行株,并建立了以四膜虫为模型评估气单胞菌毒力的方法,利用转座子插入突变技术结合四膜虫模型,筛选出新的毒力相关基因。研究结果不仅丰富了对嗜水气单胞菌致病机制的认识,同时也为毒力菌株的高通量筛选探索了一条新途径。1.嗜水气单胞菌全基因组测序及比较基因组学研究首次对分离自不同年代的嗜水气单胞菌中国流行株NJ-35和J-1进行了全基因组测序,并与已公布的嗜水气单胞菌的基因组进行了比较基因组学研究。研究结果表明,中国流行株和美国流行株的亲缘关系很近,其基因组具有高度的相似性,均属于ST251型菌株。对流行株和环境分离株毒力因子的分析结果表明,已知的毒力因子如Ⅲ型分泌系统、Ⅵ型分泌系统以及侧生鞭毛系统等并不是ST251型流行株所必需的毒力因子。另外,本研究鉴定出了包括前噬菌体、O抗原等27个基因组适应性区域,其中编码肌醇、唾液酸以及L-岩藻糖等3条代谢途径的基因区域只存在于ST251型流行株中,表明这三条代谢途径有可能是流行株与环境分离株之间的毒力差异之所在。该研究对嗜水气单胞菌的遗传信息进行了全面的破译,为其致病机制的研究提供了丰富的数据基础及新的见解。2.ST251型菌株的地理分布及致病生物学特性分析对ST251型菌株的分离地点和来源进行了溯源,确定了 ST251型菌株即为中国和美国地区的主要流行株。对30株嗜水气单胞菌毒力的分析结果表明,ST251型菌株均为有毒株。毒力因子的分析结果表明,所有菌株包括ST251型等有毒株均不含有Ⅲ型分泌系统及侧生鞭毛系统,说明这两种毒力因子并不是ST251型等强毒株发挥致病性所必需的毒力因子,而Ⅱ性分泌系统在所有菌株中均保守存在,说明该分泌系统对于细菌胞外产物的分泌是足够且必需的,但其不能作为细菌毒力的判定标识。对ST251型菌株的致病特性分析表明,ST251型菌株与其他ST型菌株在生物被膜形成能力、运动能力、胞外产物的溶血活性及蛋白酶活性等方面并不存在规律性差异,但是它们可以利用肌醇、唾液酸和L-岩藻糖来进行生长,并且在小鼠体内的存活能力更强,表明其所含有的肌醇、唾液酸和L-岩藻糖等代谢途径可能会有助于细菌在宿主体内获得营养物质,增强细菌在宿主体内的生存和增殖能力,从而使得该序列型菌株能够成为强毒力菌株,并广泛流行。3.气单胞菌毒力评估模型的建立对以四膜虫作为模型宿主评估气单胞菌毒力的可行性进行分析,分析结果表明:四膜虫与气单胞菌共培养后,菌株的相对存活率与该菌株对斑马鱼的半数致死量(LD50)呈负相关,皮尔逊相关系数为-0.683(P<0.01);而四膜虫的相对存活率与该菌株对斑马鱼的LD50呈正相关,皮尔逊相关系数为0.743(P<0.01)。经分析确定:如以细菌的相对存活率为判定依据,则相对存活率高于60%时,可判定该菌株为有毒株;低于40%时,判定为无毒株;如以四膜虫的相对存活率为判定依据,当四膜虫相对存活率低于40%时,判定该菌株为有毒株,而高于50%时,判定为无毒株。总体而言,我们成功建立了以四膜虫为模型宿主评估气单胞菌毒力的方法,为评估气单胞菌毒力提供了一条可靠、简单的途径4.嗜水气单胞菌突变体库的建立及毒力相关基因的筛选以ST251型嗜水气单胞菌流行株NJ-35为亲本株,利用转座子插入突变技术建立了含有1030株插入突变株的突变体库,并以四膜虫为模型筛选到了 94株毒力显著减弱的突变株,然后以斑马鱼为模型对其中毒力降低最明显的36株突变株的毒力再次进行评估,鉴定出了 33株半数致死量上升1个数量级以上的突变株,最终鉴定出了19个转座子插入位点,其中7个插入位点位于非编码区域,12个插入位点位于编码区域,这些被插入失活的基因主要编码菌毛基因簇的转录调节子(transcriptional regulator)、位于O抗原基因簇的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(glucose-1-phosphate thymidylyltransferase,RmlA)、几丁质酶(chitinase A,ChiA)、机械敏感性离子通道蛋白(mechanosensitive ion channel protein)以及钾离子转运子(potassium transporter,TrkH)等。对插入突变株的致病生物学特性分析表明,不同突变株对四膜虫、斑马鱼以及HEp-2细胞的毒力都有所降低,但各突变株在生长能力、运动能力等其他生物学特性上的表型并不一致。该研究鉴定出了 12个嗜水气单胞菌的毒力相关基因,加深了对该病原菌致病机制的了解,为该菌致病机制的研究提供了科学依据。5.嗜水气单胞菌chiA和trkH基因缺失株的构建及生物学特性分析针对插入突变技术筛选到的基因chiA和trkH,为了探讨其功能,采用同源重组技术,以ST251型嗜水气单胞菌NJ-35为亲本株,以pYAK1为自杀性质粒构建了chiA和trkH的基因缺失株,并以穿梭质粒pMMB207构建了相应的互补株。对缺失株、互补株和野生株的生物学特性研究表明,chiA基因缺失后,其生长能力、运动能力没有改变,但是其对四膜虫、斑马鱼以及HEp2细胞的毒力显著降低,其胞外产物的溶血活性和蛋白酶活性稍有降低,另外其在小鼠体内的存活能力也显著下降;trkH基因缺失后,其生长能力、运动能力没有改变,但是其对四膜虫、斑马鱼以及HEp-2细胞的毒力显著降低,并且其降低程度要大于chiA基因的缺失株,其胞外产物的溶血活性和蛋白酶活性也稍有降低,另外其在小鼠体内的存活能力也显著下降。本研究说明chiA和trkH两个基因在嗜水气单胞菌感染宿主的过程中起着重要的作用,可能是该病原菌发挥致病作用所必需的基因,但是其发挥作用的具体机制仍需后续的研究。