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目的:荚膜多糖(Capsular polysaccharide, C P S)和憐壁酸(Teichoic acids,TAs)均为肺炎链球菌(Streptococcus pneum onia, S.pn)表面重要的毒力因子,对细菌的体外生长、宿主体内的定植与侵袭都有重要作用,但两者生物合成途径的转录调控相关机制至今尚不清楚。我们在前期研究中通过DNA-pulldown实验发现,M arR家族蛋白FabT(SPD_0379)与S.pn的CPS合成基因簇的启动子区域以及TAs表面连接蛋白R a fX的基因启动子区域都有结合的,提示该蛋白可能对的CPS和TAs的生物合成都有调控作用。本研究旨在阐明FabT对的CPS和TAs合成的调控方式及机制,并确定其对S.pn毒力的综合影响,为细菌表面被膜合成调控相关分子机制提供新的证据。 方法:前期研究采用LFH-PCR方法构建了D39△fabT,采用锌离子诱导的异位整合质粒PJWV25及原位整合质粒pEVP3构建D39△fabT的过表达异位回补菌C o m p l1和原位回补菌Compl2。通过Dot b lo t和ELISA方法对比D39 WT、△fabT和Com pl1的荚膜和磷壁酸含量变化。通过透射电镜观察D39 W T、△fabT和C o m p ll的荚膜和细胞壁的变化。使用溶菌酶进行细菌亚组分分离,通过ELISA和Western blot和流式细胞术比较细胞壁与原生质体两者的含量变化,以进一步鉴定FabT调控TAs和 C P S合成过程的可能环节。 通过凝胶电泳迁移实验(Electrophoretic M obility Shift Assay, E M S A)验证并确定FabT与cps启动子及TAs合成相关基因启动子的相互作用。使用MEME软件分析上述启动子的DNA序列,预测并验证启动子上与FabT结合的可能的回文序列位点。采用荧光定量PCR检测有相互作用的启动子下游基因的转录水平变化。 最后通过体外抗吞噬实验、黏附侵袭实验以及小鼠肺炎和菌血症模型,探讨FabT对S.pn的毒力的综合影响。 结果:Dot b lo t和E L IS A方法分析表明,在全菌中,D39△fabT的TAs和CPS含量较D39分别W T出现显著增高,异位回补菌Compl1诱导FabT表达使两者的含量出现了显著下调(P<0.05),Western结果显示,fabT缺陷菌中C P S出现了较野生菌更小的条带,而TAs结果也出现了相似的结果。亚细胞组分的Western blot实验显示,细胞壁与原生质体中fabT缺陷菌的荚膜较野生和回补菌小分子条带明显增多,相应的大分子减少,而缺陷菌的条带中能观察到分子量更小的条带出现。流式细胞术分析同样证明,fabT缺陷菌细胞表面的荚膜与磷壁酸含量较野生菌分别增加约162.4%和335.1%。然而透射电镜结果显示,相较于D39 WT与Compl1致密的荚膜,D39△fabT出现了一种明显更加疏松的荚膜表型。 EM SA实验结果显示,FabT与cps基因簇启动子和lic1/2、lic3、psr、lytR以及rafX基因启动子序列均有结合,但与预测的回文序列片段PPS没有结合。荧光定量PCR显示,D39△fabT较D39WT的cps2A、tacF、tarI、spr1222、psr、lytR和rafX的转录水平均显著增高,且Compl1回补菌的转录水平降低至WT水平。 体外毒力实验中,为了避免荚膜对细胞黏附的影响,我们使用无荚膜的R6及其缺陷菌株进行黏附侵袭实验,可以观察到R6△fabT的黏附与侵袭能力较R6 W T显著增高,这与它们TAs变化相一致。而抗吞噬实验显示D39△fabT抗吞噬能力明显高于D39 WT,也与我们观察到表面CPS含量的增高相关。体内实验中,菌血症模型D39△fabT感染小鼠的死亡率较D39W T有所降低(p<0.05);而肺炎模型中缺陷菌感染小鼠的死亡率较野生菌显著增高(p<0.05),细菌载量结果同生存率结果相一致,缺陷菌在各器官中的细菌载量较野生菌均显著增高(p<0.05)。 结论:肺炎链球菌FabT具有转录调节因子的作用,可与多个合成TAs和C P S相关基因的启动子区域结合,对细菌TAs与C P S的合成具有负向转录调控作用。同时,它也可能正向影响到大分子CPS的合成。其介导的TAs和C P S含量变化影响到细菌的毒力,但其对细菌在不同感染模型的毒力影响并不完全一致。 目的:荚膜多糖(Capsular polysaccharide, C P S)和憐壁酸(Teichoic acids,TAs)均为肺炎链球菌(Streptococcus pneum onia, S.pn)表面重要的毒力因子,对细菌的体外生长、宿主体内的定植与侵袭都有重要作用,但两者生物合成途径的转录调控相关机制至今尚不清楚。我们在前期研究中通过DNA-pulldown实验发现,M arR家族蛋白FabT(SPD_0379)与S.pn的CPS合成基因簇的启动子区域以及TAs表面连接蛋白R a fX的基因启动子区域都有结合的,提示该蛋白可能对的CPS和TAs的生物合成都有调控作用。本研究旨在阐明FabT对的CPS和TAs合成的调控方式及机制,并确定其对S.pn毒力的综合影响,为细菌表面被膜合成调控相关分子机制提供新的证据。 方法:前期研究采用LFH-PCR方法构建了D39△fabT,采用锌离子诱导的异位整合质粒PJWV25及原位整合质粒pEVP3构建D39△fabT的过表达异位回补菌C o m p l1和原位回补菌Compl2。通过Dot b lo t和ELISA方法对比D39 WT、△fabT和Com pl1的荚膜和磷壁酸含量变化。通过透射电镜观察D39 W T、△fabT和C o m p ll的荚膜和细胞壁的变化。使用溶菌酶进行细菌亚组分分离,通过ELISA和Western blot和流式细胞术比较细胞壁与原生质体两者的含量变化,以进一步鉴定FabT调控TAs和 C P S合成过程的可能环节。 通过凝胶电泳迁移实验(Electrophoretic M obility Shift Assay, E M S A)验证并确定FabT与cps启动子及TAs合成相关基因启动子的相互作用。使用MEME软件分析上述启动子的DNA序列,预测并验证启动子上与FabT结合的可能的回文序列位点。采用荧光定量PCR检测有相互作用的启动子下游基因的转录水平变化。 最后通过体外抗吞噬实验、黏附侵袭实验以及小鼠肺炎和菌血症模型,探讨FabT对S.pn的毒力的综合影响。 结果:Dot b lo t和E L IS A方法分析表明,在全菌中,D39△fabT的TAs和CPS含量较D39分别W T出现显著增高,异位回补菌Compl1诱导FabT表达使两者的含量出现了显著下调(P<0.05),Western结果显示,fabT缺陷菌中C P S出现了较野生菌更小的条带,而TAs结果也出现了相似的结果。亚细胞组分的Western blot实验显示,细胞壁与原生质体中fabT缺陷菌的荚膜较野生和回补菌小分子条带明显增多,相应的大分子减少,而缺陷菌的条带中能观察到分子量更小的条带出现。流式细胞术分析同样证明,fabT缺陷菌细胞表面的荚膜与磷壁酸含量较野生菌分别增加约162.4%和335.1%。然而透射电镜结果显示,相较于D39 WT与Compl1致密的荚膜,D39△fabT出现了一种明显更加疏松的荚膜表型。 EM SA实验结果显示,FabT与cps基因簇启动子和lic1/2、lic3、psr、lytR以及rafX基因启动子序列均有结合,但与预测的回文序列片段PPS没有结合。荧光定量PCR显示,D39△fabT较D39WT的cps2A、tacF、tarI、spr1222、psr、lytR和rafX的转录水平均显著增高,且Compl1回补菌的转录水平降低至WT水平。 体外毒力实验中,为了避免荚膜对细胞黏附的影响,我们使用无荚膜的R6及其缺陷菌株进行黏附侵袭实验,可以观察到R6△fabT的黏附与侵袭能力较R6 W T显著增高,这与它们TAs变化相一致。而抗吞噬实验显示D39△fabT抗吞噬能力明显高于D39 WT,也与我们观察到表面CPS含量的增高相关。体内实验中,菌血症模型D39△fabT感染小鼠的死亡率较D39W T有所降低(p<0.05);而肺炎模型中缺陷菌感染小鼠的死亡率较野生菌显著增高(p<0.05),细菌载量结果同生存率结果相一致,缺陷菌在各器官中的细菌载量较野生菌均显著增高(p<0.05)。 结论:肺炎链球菌FabT具有转录调节因子的作用,可与多个合成TAs和C P S相关基因的启动子区域结合,对细菌TAs与C P S的合成具有负向转录调控作用。同时,它也可能正向影响到大分子CPS的合成。其介导的TAs和C P S含量变化影响到细菌的毒力,但其对细菌在不同感染模型的毒力影响并不完全一致。