【摘 要】
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目的:观察PTC-209处理髓系白血病细胞K562和KG-1后Bmi-1的表达情况并探究其机制;探讨PTC-209在抑制Bmi-1的表达后,K562和KG-1细胞对VP-16化疗敏感性的影响及作用机制。方法:1
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目的:观察PTC-209处理髓系白血病细胞K562和KG-1后Bmi-1的表达情况并探究其机制;探讨PTC-209在抑制Bmi-1的表达后,K562和KG-1细胞对VP-16化疗敏感性的影响及作用机制。方法:1.MTT法检测用不同浓度PTC-209作用于K562和KG-1细胞不同时间的生长抑制能力;2.RT-PCR和Western blot分别检测PTC-209以不同浓度作用两种细胞后Bmi-1 mRNA和蛋白的表达情况;3.MTT法检测化疗药物VP-16对K562和KG-1细胞的增殖抑制作用,并评估VP-16和PTC-209联合作用于两种细胞的增殖抑制能力,通过联合指数CI来判断两种药物联用对于两种细胞是否具有协同抑制作用;4.免疫荧光法检测细胞中增殖性核抗原Ki67的表达情况、DSBs标志物γ-H2AX的焦点数;5.Western blot法检测细胞DNA损伤修复相关蛋白p-ATM、ATM、p-Chk2、Chk2和线粒体凋亡途径相关蛋白Cytochrome c、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达情况;6.采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测PTC-209和VP-16单用或联用诱导细胞凋亡的情况;JC-1法检测细胞线粒体膜电位的变化。结果:1.PTC-209对K562和KG-1细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖,选取48h作为后续PTC-209的作用时间。2.不同浓度PTC-209对两种细胞中Bmi-1蛋白的表达均具有显著的抑制作用;Bmi-1 mRNA在低浓度PTC-209作用下无显著变化,在较高浓度PTC-209作用下显著下调;蛋白酶体抑制剂MG132能够逆转PTC-209对两种细胞中Bmi-1蛋白的抑制作用。3.VP-16作用48h能够显著抑制K562和KG-1细胞的增殖;PTC-209与VP-16联用对K562细胞的生长抑制具有协同作用,CI<1;PTC-209 IC10+VP-16IC40的增殖抑制率为(65.17±4.05)%,PTC-209 IC25+VP-16 IC25的抑制率为(51.31±1.46)%;对于KG-1细胞,PTC-209与VP-16联用并不总是呈协同作用,PTC-209 IC25+VP-16 IC25对KG-1细胞的抑制率为(52.03±2.94)%;PTC-209和VP-16联用与药物单用相比,K562和KG-1细胞中Ki67的表达量均明显下降。4.单用PTC-209或VP-16均可引起K562和KG-1细胞产生DNA双链断裂,γ-H2AX的表达增加,PTC-209联合VP-16作用时,相比于药物单用,γ-H2AX的表达增加更为显著,DSBs累积增多,DNA损伤检验点激活增加,相关蛋白p-ATM、p-Chk2表达明显增多。5.单用PTC-209或VP-16均可诱导K562和KG-1细胞凋亡,PTC-209和VP-16联合作用时,细胞凋亡率显著高于药物单用。6.单用PTC-209或VP-16均可引起线粒体膜电位下降,PTC-209联合VP-16作用时,相比于药物单用,线粒体膜电位的下降程度更为显著;经检测线粒体凋亡通路效应蛋白的表达情况,结果显示,相比于药物单用,PTC-209和VP-16联用使细胞中促凋亡蛋白Cytochrome c、Caspase-9、Caspase-3、Bax的表达明显增加,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达明显减少。结论:1.PTC-209对K562和KG-1细胞具有明显的增殖抑制作用,PTC-209可显著抑制两种细胞中Bmi-1的表达,其作用机制可能是抑制Bmi-1基因转录,并通过转录后调控、激活蛋白酶体通路促进其降解。2.PTC-209能够增强K562和KG-1细胞对VP-16的敏感性,其机制可能与增加DNA双链断裂、激活DNA损伤检验点、最终激活线粒体凋亡途径促进细胞凋亡有关。
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