目的:黄曲霉毒素G₁（Aflatoxin G₁,AFG₁）是一类具有致癌性的真菌毒素。我们前期实验发现模拟饮食方式经口灌胃实验小鼠AFG₁,可以诱导肺腺癌的发生;而肿瘤发生前期,AFG₁诱导肺组织慢性炎症反应,巨噬细胞浸润以及炎症细胞因子表达增加。给予TNF-α中和抗体s TNFR:Fc可以抑制AFG₁诱导的肺组织炎症反应,减少巨噬细胞浸润,提示巨噬细胞可能参与AFG₁诱导的炎症反应。已有研究表明黄曲霉毒素B₁和G₁可以刺激小鼠巨噬细胞分泌炎症细胞因子,但是在AFG₁诱导的炎症微环境中,AFG₁对巨噬细胞的激活分化及免疫功能影响尚不清楚。因此,本研究首先在AFG₁诱导的小鼠肺组织炎症反应模型中,检测肺组织巨噬细胞中TNF-α和PD-L1的表达情况,在整体水平上探讨AFG₁诱导慢性肺组织炎症反应中巨噬细胞的激活分化情况。其次,采用小鼠体外骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow derived macrophage,BMDM）原代培养的方法,培养骨髓来源单核巨噬细胞,分别给予AFG₁处理骨髓来源未分化M0巨噬细胞,以及在骨髓单核细胞向M0巨噬细胞分化前加入AFG₁预处理,探讨AFG₁对巨噬细胞M1/M2表型分子表达以及细胞极化的影响。本研究拟通过探讨AFG₁对巨噬细胞的激活情况,进一步揭示经口摄入黄曲霉毒素诱导肺组织炎症反应机制,为进一步揭示肺炎症-肺腺癌的发生机制奠定基础。方法:1. 构建灌胃AFG₁诱导Bab/c小鼠肺组织炎症模型,并给予TNF-α中和抗体s TNFR:Fc抑制肺组织炎症反应,采集对照组、灌胃AFG₁组及TNF-α阻断剂组肺组织标本,采用免疫荧光方法观察AFG₁诱导肺组织慢性炎症反应中TNF-α和PD-L1在CD68⁺巨噬细胞中表达情况。2.取Bab/c小鼠分离股骨,无菌获得骨髓单核细胞,在体外培养体系中加入巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony stimulating factor,M-CSF）,5天后得到骨髓来源巨噬细胞（BMDM,静息未分化M0型巨噬细胞）,实验给予AFG₁、M1型巨噬细胞诱导因子脂多糖（LPS）和干扰素（IFN）-γ、M2型巨噬细胞诱导因子白介素-4（IL-4）和白介素-13（IL-13）刺激24小时。检测M1型巨噬细胞标志物i NOS、TNF-α、IL-6以及M2型细胞标志物MR、YM-1、Arg-1的表达情况。检测AFG₁对巨噬细胞PD-L1表达的影响。3.分离骨髓单核细胞,加入AFG₁和M-CSF共同刺激,5天后收集M0型巨噬细胞,再分别给予相应的M1型诱导因子LPS和IFN-γ以及M2型巨噬细胞诱导因子IL-4和IL-13。观察AFG₁预处理对骨髓单核细胞向经典M1/M2巨噬细胞极化的影响。结果:1. AFG₁诱导慢性炎症反应调控CD68⁺巨噬细胞PD-L1和TNF-α的表达给予AFG₁诱导的小鼠肺组织炎症模型,同时给予TNF-α中和抗体s TNFR:Fc抑制炎症反应。免疫荧光方法发现AFG₁诱导的慢性炎症肺组织中PD-L1⁺CD68⁺和TNF-α⁺CD68⁺巨噬细胞数目增加,给予TNF-α中和抗体s TNFR:Fc抑制炎症后,PD-L1⁺CD68⁺和TNF-α⁺CD68⁺数量减少。提示AFG₁诱导慢性肺组织炎症反应是TNF-α依赖的炎症反应,上调CD68⁺巨噬细胞表达PD-L1和TNF-α,表明了AFG₁诱导巨噬细胞活化参与肺组织炎症反应。2. AFG₁对骨髓来源M0巨噬细胞免疫表型的影响体外分离培养骨髓来源M0巨噬细胞,直接给予AFG₁处理24h,RT-PCR方法显示:AFG₁上调TNF-αm RNA表达,而降低i NOS和IL-6在m RNA水平的表达（P<0.05）;检测M2型巨噬细胞相关表型分子MR、YM-1、Arg-1在m RNA水平的表达发现,AFG₁上调MR、YM-1、Arg-1的表达（P<0.05）。提示:小剂量AFG₁刺激可能会促进M0巨噬细胞向M2型极化。3. AFG₁对骨髓来源M0巨噬细胞PD-L1表达的影响给予AFG₁处理24h,RT-PCR显示:AFG₁上调PD-L1 m RNA表达（P<0.05）;FCM方法监测,AFG₁增加CD11b⁺PD-L1⁺细胞比例,并上调CD11b⁺PD-L1⁺细胞中PD-L1的表达（P<0.01）。4. 在骨髓单核细胞向M0巨噬细胞分化中,AFG₁预处理对PD-L1表达的影响在骨髓单核细胞向M0巨噬细胞分化过程中,给予小剂量AFG₁诱导5 天后,RT-PCR结果显示PD-L1 m RNA的表达上调（P<0.05）;FCM结果显示CD11b⁺PD-L1⁺细胞比例增加（P<0.05）,CD11b⁺PD-L1⁺细胞中PD-L1的表达上调（P<0.01）。在骨髓单核细胞向M0巨噬细胞分化中,AFG₁预处理上调PD-L1的表达。5. AFG₁在骨髓单核细胞向M1/M2型巨噬细胞极化中的作用在骨髓单核细胞加入AFG₁,向经典M1/M2分化成熟过程中发现:给予AFG₁预处理促进M1型诱导因子LPS+IFN-γ对TNF-αm RNA的上调作用,但是抑制LPS+IFN-γ刺激对i NOS和IL-6 m RNA的上调作用（P<0.05）;给予AFG₁预处理,促进M2型诱导因子IL-4+IL-13对M2型巨噬细胞相关表型分子表达的影响（P<0.05）。结果提示AFG₁干扰了骨髓单核细胞向经典M1型巨噬细胞极化,促进向M2型巨噬细胞极化的趋势。结论:1.整体水平上,在AFG₁诱导小鼠肺炎症微环境中,TNF-α依赖炎症反应调控CD68⁺巨噬细胞上调PD-L1和TNF-α表达。2.体外实验发现,AFG₁抑制M0巨噬细胞向M1极化,诱导骨髓来源M0巨噬细胞倾向M2型巨噬细胞极化,AFG₁上调巨噬细胞PD-L1表达,发挥免疫抑制作用。