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目的:研究证明,Rho GDI在Rho GTPases活性调节中起着非常重要的作用,Rho GDI2是Rho GDI家族中三名成员之一,在不同的肿瘤中发挥着抑癌或促癌的作用。我们前期工作表明,二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)能使Rho GDI2表达下调,且证实DADS可能通过影响Rac1/LIMK1通路,抑制胃癌细胞迁移和侵袭。Rho GDI2是位于Rac1/LIMK1通路的上游分子,本研究旨在探讨Rho GDI2沉默对DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移侵袭的作用,以阐明Rho GDI2是抗胃癌细胞侵袭转移的重要靶点。方法:构建含有编码人Rho GDI2基因序列的Rho GDI2-EGFP/真核表达载体,继而将载体转染MGC803细胞,建立Rho GDI2沉默表达的Rho GDI2/MGC803细胞系。运用RT-PCR技术和Western blot技术测定转染细胞中Rho GDI2 m RNA和Rho GDI2蛋白表达水平。运用Western blot和RT-PCR测定DADS处理前后Rho GDI2,Rac1,Pak1,Limk1的表达情况,运用划痕实验、Transwell侵袭实验和裸鼠成瘤实验,测定DADS处理前后,Rho GDI2沉默表达对MGC803细胞迁移、侵袭和成瘤能力的影响。结果:1、pc DNA6.2/Rho GDI2-mi RNA/MGC803重组细胞的构建委托上海Invitrogen公司构建pc DNA?6.2-GW/Em GFPmi R-Rho GDI2干扰质粒并成功抽提质粒。将4组干扰载体及空载体分别转入MGC803细胞,经G418筛选2周后,于显微镜下观察,可见视野内布满绿色荧光,表明阳性克隆形成。运用Western-blot技术及RT-PCR技术对沉默效率进行检测,各转染组相较于空载体转染组,Rho GDI2蛋白及m RNA表达水平均有不同程度下降,其中Rho GDI2-mi RNA1转染组沉默效果最明显,故后续试验细胞采用RhoGDI2-mi RNA1/MGC803细胞。2.Rho GDI2沉默对DADS抑制MGC803细胞迁移与侵袭的影响细胞划痕实验表明:24h后,转染组划痕间距明显小于未转染组及空载体转染组(P<0.05);经DADS处理后各组划痕间距明显小于处理前(P<0.05);经DADS处理后转染组间距明显小于经DADS处理后的未转染组(P<0.05);DADS处理前后,未转染组及空载体转染组间均不具有统计学差异(P>0.05);上述结果证实:Rho GDI2沉默能抑制细胞迁移能力,Rho GDI2沉默能增进DADS抑制细胞迁移的能力。Transwell实验表明:24h后,转染组穿膜细胞数明显少于未转染组及空载体转染组(P<0.05);经DADS处理后各组穿膜细胞数明显少于处理前(P<0.05);经DADS处理后转染组穿膜细胞数明显小于经DADS处理后未转染组(P<0.05);DADS处理前后,未转染组及空载体转染组间均不具有统计学差异(P>0.05);上述结果证实:Rho GDI2沉默明显抑制细胞侵袭能力,Rho GDI2沉默能增进DADS抑制细胞侵袭的能力。2.Rho GDI沉默与DADS对下游信号分子RAC1、PAK1及LIMK1的影响Western blotting及RT-PCR结果示,转染组相较于未转染组及空载体转染组,其RAC1、PAK1及LIMK1表达水平明显降低(P<0.05);经DADS处理24小时后,各组RAC1、PAK1及LIMK1表达水平较处理前明显降低(P<0.05);未转染组及空载体转染组处理前后其差异均不具有统计学意义(P>0.05);4.DADS与Rho GDI2沉默对细胞裸鼠成瘤能力的影响裸鼠成瘤结果显示,与未转染组相比,转染组移植瘤体积、瘤重均有明显减少(P<0.05);各DADS处理组的移植瘤体积、瘤重较未处理前明显减少(P<0.05);表明Rho GDI2沉默及DADS均可抑制MGC803细胞成瘤能力,Rho GDI2沉默可增进DADS对裸鼠成瘤能力的抑制作用。5.DADS与Rho GDI2沉默对裸鼠移植瘤细胞形态及组织内Ki-67,CD34,Vimentin,E-cadherin的影响。HE染色结果示,与未转染组相比,Rho GDI2沉默组细胞异型性降低,核浆比例减小,核染色变浅,核分裂减少。而经DADS处理后各组细胞较处理前也呈现出相同改变。免疫组化结果示,与未转染组相比,Rho GDI2沉默组Ki-67、CD34与Vimentin表达均明显减少,而E-cadherin则增加。DADS处理后,Ki-67、CD34与Vimentin表达较处理前明显下调,E-cadherin明显上调。表明Rho GDI2沉默及DADS均能上调E-cadherin表达,下调Ki-67、CD34与Vimentin表达。结论:1.Rho GDI2沉默可增强DADS对MGC803细胞迁移侵袭的抑制作用;2.Rho GDI2沉默及DADS通过Rac1/PAK1/LIMK1通路抑制MGC803细胞迁移侵袭;3.Rho GDI2沉默可增强DADS抑制MGC803细胞的成瘤能力。