胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）属于丝氨酸蛋白酶家族,可以特异性地切割碱性氨基酸,如赖氨酸和精氨酸的羧基端肽键,广泛应用于制药行业。胰蛋白酶易从动物（猪、牛等）的胰脏中提取,但是提取的胰蛋白酶纯度较低,含有大量其他蛋白酶,而且为动物来源,存在未知病毒和外源因子污染的风险。随着法规的趋于严格,提取的胰蛋白酶应用范围越来越窄,基因重组的胰蛋白酶得到广泛应用。本文描述了一种基于QbD（质量源于设计,Quality by Design）理念的重组胰蛋白酶工艺的开发方法,通过本文描述的开发方法建立胰蛋白酶生产工艺,其产品纯度高且活性高,生产的重组胰蛋白酶可应用于到其他产品的生产中。本文通过QbD的方法确定整体工艺开发策略,上游的工艺开发主要研究内容包括摇瓶种子培养、种子罐发酵培养、发酵罐发酵培养的工艺开发。结果获得一个成熟稳定的上游生产工艺如下:摇瓶培养接种量为0.5%,培养温度在28³2℃,培养时间不超过24 h,OD₆₀₀达到19³2;种子罐培养接种量为0.5%¹.0%,培养温度在28³2℃之间,溶氧≥40%,培养时间15²4 h,OD₆₀₀达到18³1;发酵罐培养接种量2.5⁷.5%,以尿素为氮源,诱导温度为25²8℃,过程控制pH值在4.0⁵.0之间,发酵周期90¹10 h。其次,通过QbD的方法对于下游纯化工艺进行开发。主要研究内容包括酶原捕获、活化、超滤、冻干工艺,最终获得的稳定的下游生产工艺为:酶原捕获层析,上样载量为57 g/L,上样和洗脱流速为0.08⁰.25 CV/min,洗脱条件为pH 3.0⁴.0、40⁶0 mM的氯化钠溶液洗脱3 CV;在Ca²⁺浓度达到40⁸0 mM,pH 7.5⁸.0条件下活化4⁵ h;使用8K超滤膜,系统允许最大的跨膜压条件下2 h内完成超滤步骤,在-20℃下预冻3 h后,主冻干温度为8℃,终冻干温度为25℃条件下,冻干24 h,可获得符合质量标准的冻干粉。再次,通过生产数据以及胰蛋白酶在其他项目中的应用实例阐述,证明开发的工艺既可以进行放大生产,也拥有较好的产品质量。工艺上游表达量>7.5 g/L,下游总收率>15%,所得胰蛋白酶产品纯度≥73.5%,酶活力达到≥3856 IU/mg。本论文旨在阐述一种新的重组胰蛋白酶生产工艺,利用FDA（Food and Drug Administration、美国食品药品管理局）推荐的Qb D理念进行重组胰蛋白酶的工艺开发,最终获得了稳定的可放大的生产工艺,为商品产业化提供研究基础,为其他项目开发提供参考。