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棉花是世界上最重要的天然纤维作物，其纤维是纺织工业主要原材料。我国是世界上最大的纺织品生产国和出口国，棉花生产在我国国民经济中占有十分重要的地位。棉花纤维从胚珠表皮分化发育而来，具有极度伸长的单细胞结构。这一特点使棉花纤维成为研究植物细胞分化和极性生长的理想材料。纤维细胞起始是棉花纤维发育的第一阶段，这一过程决定了纤维细胞的数量，进而影响纤维产量和品质。
多种植物激素，如生长素（Auxin）、细胞分裂素（cytokinins，CKs）、赤霉素（gibberellins，GAs）、油菜素类固醇（brassinosteroids，BRs）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）等参与调控棉花纤维的起始。吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是最主要的天然活性生长素。本实验室前期研究发现，生长素在棉花开花当天起始的纤维细胞中特异积累，通过时空精确调控IAA的生物合成，促进纤维细胞的起始，可同步提高棉花的产量和品质。但是，生长素在棉花胚珠表皮纤维与非纤维细胞间不对称分布的形成机制尚不清楚。
细胞分裂素与生长素的互作参与调控了诸多植物生长发育的进程。但是细胞分裂素与生长素的互作在棉花纤维中的作用仍有待研究。
针对上述问题，本文分析了纤维发育过程中细胞分裂素与生长素的动态变化，通过胚珠培养结合转基因技术研究了细胞分裂素、生长素和它们二者的拮抗对纤维发育的影响。同时研究了胚珠表皮细胞中生长素的来源和生长素外运载体在棉花胚珠中的表达模式。结果发现，生长素外运载体介导的生长素极性运输（polar auxin transport，PAT）调控了棉花胚珠表皮生长素的积累。生长素外运蛋白GhPIN3a是棉花纤维起始过程中生长素的重要运输载体，它极性定位于非纤维细胞的质膜上，而在纤维细胞的质膜上没有定位。GhPIN3a在非纤维与纤维细胞间的不同蛋白定位导致生长素在纤维细胞中的积累。另外，过量细胞分裂素能够破坏 GhPIN3a在非纤维细胞中的极性定位，干扰棉花胚珠表皮生长素的极性运输和不对称分布的建立，从而抑制棉花纤维起始。论文的主要结果如下：
1、细胞分裂素与生长素在棉花纤维起始过程中存在拮抗关系
（1）利用LC-MS/MS分析了陆地棉（Gossypium hirsutumL.）栽培种“Jimian 14”胚珠和纤维发育过程中细胞分裂素与IAA的动态变化。结果显示，细胞分裂素在开花后的棉花胚珠和纤维中呈现不断降低的趋势；IAA与细胞分裂素相反，呈现逐渐升高的趋势。（2）利用细胞分裂素诱导启动子 proTCS 和生长素诱导启动子proDR5控制GUS报告基因的转基因棉花，原位观察了细胞分裂素与生长素水平在胚珠和纤维中的动态变化。观察结果佐证了细胞分裂素与IAA在棉花胚珠和纤维发育过程中的相反变化趋势。（3）胚珠离体培养试验结果显示，生长素促进棉花纤维起始，而细胞分裂素抑制棉花纤维起始，并且都存在剂量效应。在棉花胚珠中干扰细胞分裂素氧化酶编码基因GhCKX3的表达，proPV:antisenseGhCKX3转基因棉花与野生型相比开花当天胚珠中细胞分裂素（ZT）含量明显增加，胚珠表面纤维起始密度显著降低，支持了离体培养时细胞分裂素抑制棉花纤维起始的结果。（4）用生长素诱导启动子和细胞分裂素诱导启动子分别控制细胞分裂素和生长素的生物合成（proDR5:IPT和proTCS:iaaM），研究细胞分裂素与生长素在棉花纤维中的原位互作，结果表明生长素诱导产生的细胞分裂素可以削弱生长素对棉花纤维起始的促进作用；而细胞分裂素诱导产生的生长素可以缓解细胞分裂素对棉花纤维起始的抑制作用。上述结果表明，细胞分裂素与生长素在调控棉花纤维起始过程中存在拮抗关系。
2、细胞分裂素干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累并抑制纤维起始
无纤维突变体xu142fl是研究棉花纤维细胞起始的良好材料。（1）激素检测结果表明，纤维起始时期无纤维突变体xu142fl胚珠中的生长素和细胞分裂素含量均明显高于野生型。（2）通过杂交将proDR5:GUS和proTCS:GUS报告系统分别导入无纤维突变体xu142fl，并在杂交F2代中分离出含有激素诱导报告系统的无纤维（proDR5:GUS xu142fl和proTCS:GUS xu142fl）和野生型（proDR5:GUSXu142FL和proTCS:GUS Xu142FL）表型植株。开花当天胚珠的GUS染色结果显示，突变体胚珠外珠被和合点区域的细胞分裂素信号（用proTCS:GUS报告系统指示）明显强于野生型胚珠。对于生长素信号（用proDR5:GUS报告系统指示），突变体胚珠表皮的信号缺失，但是在珠心的信号明显强于野生型胚珠。这些结果表明，胚珠表皮生长素的缺失而不是整个胚珠生长素含量的减少导致了xu142fl突变体的无纤维表型。无纤维突变体xu142fl胚珠外珠被中过量的细胞分裂素水平阻碍了胚珠表皮生长素的积累。（3）proDR5:GUS胚珠用ZT处理，其胚珠表皮proDR5:GUS表达和纤维生长的结果显示，生长素积累减少；同时纤维的起始被抑制。该结果表明过量的细胞分裂素能够干扰棉花胚珠表皮生长素的不对称积累，从而抑制纤维起始。3、生长素外运蛋白介导的生长素极性运输对棉花胚珠表皮中生长素的积累和纤维起始有至关重要的作用
（1）生长素饥饿实验表明，从头合成的生长素不是供给棉花纤维起始的主要生长素来源（。2）在棉花开花前用1-N-氨甲酰苯甲酸萘酯（1-N-naphthylphthalamic， NPA）抑制花柄中生长素的运输，减少开花当天子房、珠心和胚珠表皮生长素的积累，抑制纤维起始。这表明供给棉花纤维起始的生长素主要通过花柄从外部组织运进子房。（3）离体实验显示，生长素外运抑制剂NPA和布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）可明显抑制胚珠表皮生长素的积累和纤维起始；但生长素内运抑制剂萘氧基乙酸（1-naphthoxyacetic acid，1-NOA）对胚珠表皮生长素的积累和纤维起始无明显抑制作用。以上结果表明，生长素外运蛋白介导的生长素极性运输对棉花胚珠表皮中生长素的积累和纤维起始有至关重要的作用。
4、GhPIN3a 在非纤维与纤维细胞中的不同蛋白定位决定了棉花胚珠表皮生长素的不对称分布
（1）mRNA原位杂交表明，在开花当天的胚珠外珠被中生长素外运蛋白基因GhPIN3a优势表达，可能参与纤维起始过程中胚珠表皮生长素的积累。（2）种皮特异性下调GhPIN3a的表达，严重甚至完全抑制proBAN:GhPIN3a-RNAi转基因棉花胚珠表皮纤维的起始，证明了纤维起始过程中 GhPIN3a 的关键作用。（3） GhPIN3a:YFP 信号主要出现在非纤维细胞的质膜上，而在临近的纤维细胞的质膜上没有相应信号。该结果表明，生长素能够通过非纤维细胞在胚珠表皮运输；GhPIN3a 在纤维细胞质膜上定位的缺失使进入纤维细胞中的生长素不能通过外运载体流出，从而导致生长素在其中不断积累。
5、细胞分裂素通过干扰 GhPIN3a 的表达和蛋白定位拮抗生长素对纤维起始的促进作用
（1）ZT处理胚珠中GhPIN3a的转录水平明显下降；同时，在细胞分裂素含量异常升高的无纤维突变体 xu142fl 外珠被中也检测到 GhPIN3a 转录水平下降的结果；此外，ZT处理proGhPIN3a:GUS转基因棉花开花当天的胚珠，其表皮的GUS信号也明显降低。这些结果表明，细胞分裂素可以抑制GhPIN3a转录。（2）ZT处理棉花开花当天的胚珠，其表皮细胞质膜上GhPIN3a的定位信号几乎消失。这表明，细胞分裂素不仅会抑制棉花胚珠中GhPIN3a的转录，还会破坏其编码蛋白在质膜上的定位，从而干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累，抑制纤维起始。
综上所述，本研究的结果表明，棉花纤维起始过程中GhPIN3a在非纤维与纤维细胞间的不同蛋白定位导致了生长素在胚珠表皮的不对称积累。过量的细胞分裂素能够通过干扰 GhPIN3a 的表达及其在细胞质膜上的定位破坏棉花胚珠表皮GhPIN3a 介导的生长素极性运输，从而拮抗生长素对纤维起始的促进作用。GhPIN3a 在棉花胚珠表皮细胞间的不同蛋白定位为进一步揭示生长素在单细胞中积累的潜在机制奠定了基础。
多种植物激素，如生长素（Auxin）、细胞分裂素（cytokinins，CKs）、赤霉素（gibberellins，GAs）、油菜素类固醇（brassinosteroids，BRs）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）等参与调控棉花纤维的起始。吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是最主要的天然活性生长素。本实验室前期研究发现，生长素在棉花开花当天起始的纤维细胞中特异积累，通过时空精确调控IAA的生物合成，促进纤维细胞的起始，可同步提高棉花的产量和品质。但是，生长素在棉花胚珠表皮纤维与非纤维细胞间不对称分布的形成机制尚不清楚。
细胞分裂素与生长素的互作参与调控了诸多植物生长发育的进程。但是细胞分裂素与生长素的互作在棉花纤维中的作用仍有待研究。
针对上述问题，本文分析了纤维发育过程中细胞分裂素与生长素的动态变化，通过胚珠培养结合转基因技术研究了细胞分裂素、生长素和它们二者的拮抗对纤维发育的影响。同时研究了胚珠表皮细胞中生长素的来源和生长素外运载体在棉花胚珠中的表达模式。结果发现，生长素外运载体介导的生长素极性运输（polar auxin transport，PAT）调控了棉花胚珠表皮生长素的积累。生长素外运蛋白GhPIN3a是棉花纤维起始过程中生长素的重要运输载体，它极性定位于非纤维细胞的质膜上，而在纤维细胞的质膜上没有定位。GhPIN3a在非纤维与纤维细胞间的不同蛋白定位导致生长素在纤维细胞中的积累。另外，过量细胞分裂素能够破坏 GhPIN3a在非纤维细胞中的极性定位，干扰棉花胚珠表皮生长素的极性运输和不对称分布的建立，从而抑制棉花纤维起始。论文的主要结果如下：
1、细胞分裂素与生长素在棉花纤维起始过程中存在拮抗关系
（1）利用LC-MS/MS分析了陆地棉（Gossypium hirsutumL.）栽培种“Jimian 14”胚珠和纤维发育过程中细胞分裂素与IAA的动态变化。结果显示，细胞分裂素在开花后的棉花胚珠和纤维中呈现不断降低的趋势；IAA与细胞分裂素相反，呈现逐渐升高的趋势。（2）利用细胞分裂素诱导启动子 proTCS 和生长素诱导启动子proDR5控制GUS报告基因的转基因棉花，原位观察了细胞分裂素与生长素水平在胚珠和纤维中的动态变化。观察结果佐证了细胞分裂素与IAA在棉花胚珠和纤维发育过程中的相反变化趋势。（3）胚珠离体培养试验结果显示，生长素促进棉花纤维起始，而细胞分裂素抑制棉花纤维起始，并且都存在剂量效应。在棉花胚珠中干扰细胞分裂素氧化酶编码基因GhCKX3的表达，proPV:antisenseGhCKX3转基因棉花与野生型相比开花当天胚珠中细胞分裂素（ZT）含量明显增加，胚珠表面纤维起始密度显著降低，支持了离体培养时细胞分裂素抑制棉花纤维起始的结果。（4）用生长素诱导启动子和细胞分裂素诱导启动子分别控制细胞分裂素和生长素的生物合成（proDR5:IPT和proTCS:iaaM），研究细胞分裂素与生长素在棉花纤维中的原位互作，结果表明生长素诱导产生的细胞分裂素可以削弱生长素对棉花纤维起始的促进作用；而细胞分裂素诱导产生的生长素可以缓解细胞分裂素对棉花纤维起始的抑制作用。上述结果表明，细胞分裂素与生长素在调控棉花纤维起始过程中存在拮抗关系。
2、细胞分裂素干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累并抑制纤维起始
无纤维突变体xu142fl是研究棉花纤维细胞起始的良好材料。（1）激素检测结果表明，纤维起始时期无纤维突变体xu142fl胚珠中的生长素和细胞分裂素含量均明显高于野生型。（2）通过杂交将proDR5:GUS和proTCS:GUS报告系统分别导入无纤维突变体xu142fl，并在杂交F2代中分离出含有激素诱导报告系统的无纤维（proDR5:GUS xu142fl和proTCS:GUS xu142fl）和野生型（proDR5:GUSXu142FL和proTCS:GUS Xu142FL）表型植株。开花当天胚珠的GUS染色结果显示，突变体胚珠外珠被和合点区域的细胞分裂素信号（用proTCS:GUS报告系统指示）明显强于野生型胚珠。对于生长素信号（用proDR5:GUS报告系统指示），突变体胚珠表皮的信号缺失，但是在珠心的信号明显强于野生型胚珠。这些结果表明，胚珠表皮生长素的缺失而不是整个胚珠生长素含量的减少导致了xu142fl突变体的无纤维表型。无纤维突变体xu142fl胚珠外珠被中过量的细胞分裂素水平阻碍了胚珠表皮生长素的积累。（3）proDR5:GUS胚珠用ZT处理，其胚珠表皮proDR5:GUS表达和纤维生长的结果显示，生长素积累减少；同时纤维的起始被抑制。该结果表明过量的细胞分裂素能够干扰棉花胚珠表皮生长素的不对称积累，从而抑制纤维起始。3、生长素外运蛋白介导的生长素极性运输对棉花胚珠表皮中生长素的积累和纤维起始有至关重要的作用
（1）生长素饥饿实验表明，从头合成的生长素不是供给棉花纤维起始的主要生长素来源（。2）在棉花开花前用1-N-氨甲酰苯甲酸萘酯（1-N-naphthylphthalamic， NPA）抑制花柄中生长素的运输，减少开花当天子房、珠心和胚珠表皮生长素的积累，抑制纤维起始。这表明供给棉花纤维起始的生长素主要通过花柄从外部组织运进子房。（3）离体实验显示，生长素外运抑制剂NPA和布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）可明显抑制胚珠表皮生长素的积累和纤维起始；但生长素内运抑制剂萘氧基乙酸（1-naphthoxyacetic acid，1-NOA）对胚珠表皮生长素的积累和纤维起始无明显抑制作用。以上结果表明，生长素外运蛋白介导的生长素极性运输对棉花胚珠表皮中生长素的积累和纤维起始有至关重要的作用。
4、GhPIN3a 在非纤维与纤维细胞中的不同蛋白定位决定了棉花胚珠表皮生长素的不对称分布
（1）mRNA原位杂交表明，在开花当天的胚珠外珠被中生长素外运蛋白基因GhPIN3a优势表达，可能参与纤维起始过程中胚珠表皮生长素的积累。（2）种皮特异性下调GhPIN3a的表达，严重甚至完全抑制proBAN:GhPIN3a-RNAi转基因棉花胚珠表皮纤维的起始，证明了纤维起始过程中 GhPIN3a 的关键作用。（3） GhPIN3a:YFP 信号主要出现在非纤维细胞的质膜上，而在临近的纤维细胞的质膜上没有相应信号。该结果表明，生长素能够通过非纤维细胞在胚珠表皮运输；GhPIN3a 在纤维细胞质膜上定位的缺失使进入纤维细胞中的生长素不能通过外运载体流出，从而导致生长素在其中不断积累。
5、细胞分裂素通过干扰 GhPIN3a 的表达和蛋白定位拮抗生长素对纤维起始的促进作用
（1）ZT处理胚珠中GhPIN3a的转录水平明显下降；同时，在细胞分裂素含量异常升高的无纤维突变体 xu142fl 外珠被中也检测到 GhPIN3a 转录水平下降的结果；此外，ZT处理proGhPIN3a:GUS转基因棉花开花当天的胚珠，其表皮的GUS信号也明显降低。这些结果表明，细胞分裂素可以抑制GhPIN3a转录。（2）ZT处理棉花开花当天的胚珠，其表皮细胞质膜上GhPIN3a的定位信号几乎消失。这表明，细胞分裂素不仅会抑制棉花胚珠中GhPIN3a的转录，还会破坏其编码蛋白在质膜上的定位，从而干扰生长素在棉花胚珠表皮的积累，抑制纤维起始。
综上所述，本研究的结果表明，棉花纤维起始过程中GhPIN3a在非纤维与纤维细胞间的不同蛋白定位导致了生长素在胚珠表皮的不对称积累。过量的细胞分裂素能够通过干扰 GhPIN3a 的表达及其在细胞质膜上的定位破坏棉花胚珠表皮GhPIN3a 介导的生长素极性运输，从而拮抗生长素对纤维起始的促进作用。GhPIN3a 在棉花胚珠表皮细胞间的不同蛋白定位为进一步揭示生长素在单细胞中积累的潜在机制奠定了基础。