四螨嗪微生物降解菌株S-8的分离、鉴定及降解特性研究

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四螨嗪,结构式为3,6-双(2-氯苯基)-1,2,4,5-四嗪,是一种有机氮杂环类杀螨剂。高浓度的四螨嗪溶液呈现红色,杀螨效率高、使用安全、效用多、药效持续时间长,主要用于防治苹果全爪螨、柑橘锈螨、山楂叶螨、柑橘四斑黄蜘蛛、朱砂叶螨、锈壁虱等多种植物害螨。四螨嗪是一种毒性中等的杀螨剂,在环境中表现出高效的起始活性和残留活性。环境中残留的四螨嗪通过生物富集作用在食物链中转移,最终危害食品安全及人类健康。近年来,四螨嗪的残留及其修复越来越受到重视。微生物降解因其所具有的环境友好性、高效性和经济可行性成为当今农药残留污染修复的主要手段。然而,国内外关于四螨嗪微生物降解的研究还未见报道。本研究的目的在于分离筛选出高效的四螨嗪降解菌株,并探讨该菌株对四螨嗪的降解特性,为四螨嗪污染环境的微生物修复提供菌株资源和理论依据。本论文采用连续富集传代培养的方法,从长期生产四螨嗪的某农药厂附近土壤中分离筛选出一株四螨嗪降解菌株,命名为S-8,这是目前首次分离到的四螨嗪降解菌株。经生理生化特征和16S rRNA基因序列分析,将菌株S-8初步鉴定为分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)。菌株S-8在pH值为6.0~8.0时生长良好,最适生长pH值为7.0,最适生长温度为30℃,NaCl浓度在5~20 g/L范围内时菌株生长状况良好,2 mM Cd2+、Cu2+或Ni2+对菌株S-8的生长均具有较强的抑制作用,在250mL三角瓶中装液量大于150mL的情况下,菌株S-8的生长受到影响,说明通气量下降会影响菌株S-8的生长。菌株S-8能在60 h内降解富集培养基中30 mg/L的四螨嗪,菌株S-8降解四螨嗪的最适温度为30℃,最适pH值为7.0;不添加金属离子,菌株S-8降解四螨嗪的降解率为92.38%,添加2 mM Cu2+降解率为18.6%,Cu2+对菌株S-8降解四螨嗪具有很强的抑制作用;2 mMNi2+或Cd2+也存在一定抑制作用,降解率只有42.39%和41.76%,不添加碳源,菌株S-8降解四螨嗪的降解率为3.08%,加入1 g/L淀粉或葡萄糖能明显提高降解效果,降解率分别为94.05%和93.07%。利用高效液相色谱(HPLC)和串联质谱(MS/MS)技术对菌株S-8降解代谢四螨嗪的产物进行了鉴定,发现生成的产物为3,6-双(2-氯苯基)-1,2-二氩-1,2,4,5-四嗪,为四螨嗪-N=N-双键加氢还原的产物。对收集的产物进行生物毒性比较,发现分别加入相同浓度四螨嗪和代谢产物的培养基上的酿酒酵母菌的生长量在P<0.05水平上差异性显著,产物的生物毒性明显低于其母体四螨嗪,显示菌株S-8对四螨嗪的还原加氩过程是一个生物脱毒过程。对菌株S-8粗酶液降解四螨嗪的酶学特性进行了研究,酶学反应体系为:2mL粗酶液,30 mg/L四螨嗪,100 min反应时间,发现NADH是更适的电子供体;温度低于37℃时酶的热稳定性好,高于37℃热稳定性逐渐降低;菌株S-8粗酶液降解四螨嗪的最适温度为30~42℃;最适pH值为7.0;1 mM的Fe2+或Ca2+对粗酶液的降解有一定促进作用,分别能将相对酶活提高13.56%和15.62%,而相同浓度的Cu2+、Co2+或Mn2+则有明显的抑制作用,分别将相对酶活降低了 78.79%、89.7%和94.55%;100 mM EDTA几乎能完全抑制菌株S-8粗酶液的活性,相对酶活为4.47%;在厌氧条件下,菌株S-8粗酶液活性要高于有氧环境,在30 h内分别能将30 mg/L的四螨嗪降解92.93%和85.97%。菌株S-8粗酶液对四螨嗪的Vmax/Km为10.79min-1.mg-1
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