水稻抗白叶枯病基因Xa48(t)分离克隆及种质创制

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水稻是世界上重要的粮食作物,由革兰氏阴性菌黄单孢菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病在我国各地均有发生,通常使稻谷生产量降低40%以上。长期生产实践表明发掘并利用抗病新基因、培育抗病种质在解决水稻白叶枯病这一问题上更具经济价值和生态意义。课题组前期研究发现并鉴定一个来自云南耿马县的地方稻种毫糯扬(Haonuoyang,HNY)对白叶枯病表现出中抗以上抗性水平,确定HNY携带一个新抗白叶枯病基因暂时命名为Xa48(t)。为分离克隆HNY携带的Xa48(t),初步探究该基因的功能与作用并创制抗白叶枯病的优异材料,本研究利用HNY近等基因系H197与JG30杂交后代分离群体对Xa48(t)进行精细定位并筛选出5个候选基因。通过ORFs预测、qRT-PCR表达量检测、转基因植株功能互补验证的方法进一步筛选Xa48(t)候选基因,初步探究该基因抗性水平与部分植物内源激素、植物外源激素的关系。通过亚细胞定位、观测超微细胞结构、盐胁迫、干旱胁迫、接种稻瘟病菌等方法初步探究Xa48(t)基因的抗病机制及功能作用。主要如下:(1)在初步定位的基础上,本文设计开发出符合目标区段的KASP标记,将Xa48(t)精细定位于水稻(水稻品种日本晴)第11号染色体长臂端28849494-28894443 bp之间的40.5 kb区段上。通过分析筛选出5个与抗病相关的候选基因:Osllg47860、Osllg47870、Osllg47890、Osllg47900和Osllg47910。(2)通过设计ORFs特异性引物扩增测序分析5个候选基因在抗病品种HNY与其他水稻品种当中的DNA序列差异及检测5个候选基因在Xoo胁迫下的表达量初步确认Os11g47910与水稻白叶枯病高度相关;随后通过转基因植株接种白叶枯病鉴定验证,最终确定Os11g47910是Xa48(t)并将其分离克隆,发现该基因编码GRAS家族蛋白,在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用。(3)通过水稻耐盐性、耐旱性、抗稻瘟病的分析,我们发现基因Xa48(t)在水稻耐盐性、耐旱性方面无明显作用,但在抗稻瘟病过程中有一定作用。(4)通过观测HNY白叶枯病接种口处的超微细胞结构,初步明确抗白叶枯病基因Xa48(t)在细胞机制学中的功能作用:Xa48(t)介导的抗病反应中普遍存在细胞自噬,为植物体提供完整细胞支撑并增强基础抗性水平,进而抵御白叶枯病菌。(5)通过分析Xa48(t)与其他抗病相关基因及激素类基因间的作用关系,初步明确该基因受JA途径控制,引起PR基因的表达,介导多个类型的抗病反应。(6)通过亚细胞定位研究发现荧光质粒与Xa48(t)融合载体在细胞膜上表达出绿色荧光。(7)通过利用HNY与优质材料杂交,创制出3个具有良好抗性、多个抗白叶枯病基因聚合的优异抗白叶枯病株系,收获优质后代稻种1000粒以上。综上,通过对抗白叶枯病基因的挖掘、分离克隆、功能分析及种质创制研究,拓宽了抗病基因的研究视野,丰富了抗病基因资源库,为水稻抗病育种提供了丰富的理论和材料基础。
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