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目的：随着免疫抑制剂的广泛使用以及重症感染病人的增加，全世界的真菌感染发病率逐年上升。此外，手术病人增多和住院天数的增加也导致院内真菌感染的防控面临严峻挑战。临床上，从真菌感染病人血、痰、尿等送检样本中分离的菌株中大部分是念珠菌，而其中白念珠菌的占比又超过40%。因此防治临床上白念珠菌感染，尤其是白念珠菌侵袭性感染至关重要。目前，临床可用的有效抗真菌药物与其他抗细菌或者抗病毒类药物相比，数量十分有限，而且抗真菌药物的长周期使用也容易导致真菌耐药的产生。真菌作为真核生物，与哺乳动物细胞多有相似，因此抗真菌药物易对人体产生毒副作用，这也使抗真菌药物的研究进展缓慢，临床迫切需要研发新的有效的抗耐药真菌的药物。为了解决抗真菌药物的毒副作用和耐药性问题，本课题组一直致力于研究增强现有抗真菌药物敏感性的抗真菌增效剂，包括化学小分子药物和生物大分子药物。本课题延续课题组的研究方向，通过化合物库筛选及前期活性化合物的结构改造，获得了协同氟康唑抗菌的化合物FQ-17和CZ-66以及协同卡泊芬净的化合物硬脂酸单甘油酯，并初步探讨了CZ-66与氟康唑合用使真菌胞内ROS升高，并破坏细胞壁和细胞膜的作用机制，为抗耐药真菌联合用药研究提供了新思路。
方法和结果：1.本课题考察了CZ-66与不同类型的临床常用抗真菌药物的合用效果，明确了CZ-66与氟康唑合用的抗真菌谱。首先通过体外筛选考察了CZ-65、CZ-66及吩嗪类衍生物的抗真菌活性，发现单用CZ-65、CZ-66及吩嗪类衍生物对临床常见致病真菌白念珠菌都没有明显的抗菌活性；利用棋盘式微量液基稀释法检测了CZ-65、CZ-66、吩嗪类衍生物与氟康唑合用以及硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净合用对常见临床感染真菌的抗菌谱，结果显示CZ-65与氟康唑合用对临床常见致病念珠菌的抗菌活性不明显；CZ-66、FQ-12、FQ-17和FQ-18与氟康唑合用能明显增强氟康唑的抗真菌活性，而硬脂酸单甘油酯可以增强卡泊芬净的抗念珠菌活性。之后用棋盘式微量液基稀释法，筛选了更多的临床真菌，结果显示CZ-66协同氟康唑对80%以上的临床耐药菌有协同抗真菌效果。此外，还选取了卡泊芬净、两性霉素B、5-氟胞嘧啶等临床常用抗真菌药物和CZ-66合用，结果显示CZ-66与上述药物均有协同抗真菌活性。
2.本研究选取白念珠菌为代表，利用琼脂纸片扩散实验法考察CZ-66单药、氟康唑单药以及CZ-66协同氟康唑的抑菌圈，结果发现协同用药的纸片周边无真菌生长，而单药的纸片周边都有真菌生长，表明CZ-66协同氟康唑可能存在杀真菌作用。
3.绘制CZ-66协同氟康唑对真菌的生长曲线和杀菌曲线，结果发现0.5μg/mLCZ-66协同0.5μg/mL氟康唑仍有显著的杀菌作用，进一步验证了CZ-66与氟康唑协同有杀菌作用。
4.考察了CZ-66对白念珠菌菌丝形成的影响。在不同的培养基中分别加入CZ-66单药、氟康唑单药及两药合用对诱导菌丝形成的影响，结果显示无论单药还是两药合用均不能抑制菌丝的形成。
5.利用荧光探针DCFH-DA测定了CZ-66单药、氟康唑单药以及CZ-66与氟康唑合用后对细胞内活性氧(ROS)的影响。结果发现CZ-66与氟康唑合用比单药作用下的细胞内ROS水平显著升高，加入抗氧化剂Vc和谷胱甘肽后，CZ-66与氟康唑合用的杀菌有所减弱，证明CZ-66协同氟康唑的杀菌作用部分依赖于ROS的升高。
6.真菌细胞壁疏水性考察发现，CZ-66与氟康唑合用后白念珠菌细胞壁表面疏水性发生显著变化，透射电镜观察显示，两药合用后真菌细胞壁和细胞膜出现严重损伤，提示CZ-66与氟康唑导致真菌的细胞壁和细胞膜损伤，发挥协同杀真菌作用。
7.为了探究CZ-66的作用靶点，本课题利用DARTS的实验方法，考察与CZ-66相互作用的靶点蛋白。通过探索CZ-66与白念珠菌总蛋白作用的实验条件，包括蛋白酶浓度、蛋白与药物作用时间，胶的浓度以及CZ-66的不同浓度。最终发现，加入10mM的CZ-66，在55-60kD的位置出现一个差异条带。对条带进行质谱鉴定，通过峰面积、分子量、蛋白生物信息学的分析和蛋白功能的分析，初步推断Cdc19p可能是CZ-66的作用靶点。之后，利用棋盘式微量液基稀释法在发酵碳源(葡萄糖、蔗糖、半乳糖等)培养基和非发酵碳源(甘油)培养基中进行体外抗真菌研究，发现在发酵碳源和非发酵碳源中均具有的协同抗真菌作用，但在非发酵碳源培养基中协同作用明显减弱，初步验证CZ-66可能通过影响Cdc19p的功能发挥抗真菌作用，具体的作用靶点和机制还需进一步研究。
结论：本课题通过吩嗪类衍生物和前期结构改造系列化合物的筛选，得到了与氟康唑协同的抗真菌的化合物CZ-66、FQ-12、FQ-17、FQ-18以及与卡泊芬净协同的硬脂酸单甘油酯。采用棋盘式微量液基稀释法，选用多种临床抗真菌常用药和CZ-66合用，发现与氮唑类有协同杀菌活性。CZ-66与氟康唑合用可以升高胞内ROS，同时导致白念珠菌细胞壁和细胞膜出现明显损伤，细胞表面疏水性改变。此外，为了进一步探讨CZ-66的作用靶点，本课题成功建立了CZ-66体外与白念珠菌蛋白作用的DARTS体系，并找到差异条带，质谱鉴定后，初步推断Cdc19p可能是CZ-66的作用靶点，但具体的作用机制还需进一步研究。
方法和结果：1.本课题考察了CZ-66与不同类型的临床常用抗真菌药物的合用效果，明确了CZ-66与氟康唑合用的抗真菌谱。首先通过体外筛选考察了CZ-65、CZ-66及吩嗪类衍生物的抗真菌活性，发现单用CZ-65、CZ-66及吩嗪类衍生物对临床常见致病真菌白念珠菌都没有明显的抗菌活性；利用棋盘式微量液基稀释法检测了CZ-65、CZ-66、吩嗪类衍生物与氟康唑合用以及硬脂酸单甘油酯与卡泊芬净合用对常见临床感染真菌的抗菌谱，结果显示CZ-65与氟康唑合用对临床常见致病念珠菌的抗菌活性不明显；CZ-66、FQ-12、FQ-17和FQ-18与氟康唑合用能明显增强氟康唑的抗真菌活性，而硬脂酸单甘油酯可以增强卡泊芬净的抗念珠菌活性。之后用棋盘式微量液基稀释法，筛选了更多的临床真菌，结果显示CZ-66协同氟康唑对80%以上的临床耐药菌有协同抗真菌效果。此外，还选取了卡泊芬净、两性霉素B、5-氟胞嘧啶等临床常用抗真菌药物和CZ-66合用，结果显示CZ-66与上述药物均有协同抗真菌活性。
2.本研究选取白念珠菌为代表，利用琼脂纸片扩散实验法考察CZ-66单药、氟康唑单药以及CZ-66协同氟康唑的抑菌圈，结果发现协同用药的纸片周边无真菌生长，而单药的纸片周边都有真菌生长，表明CZ-66协同氟康唑可能存在杀真菌作用。
3.绘制CZ-66协同氟康唑对真菌的生长曲线和杀菌曲线，结果发现0.5μg/mLCZ-66协同0.5μg/mL氟康唑仍有显著的杀菌作用，进一步验证了CZ-66与氟康唑协同有杀菌作用。
4.考察了CZ-66对白念珠菌菌丝形成的影响。在不同的培养基中分别加入CZ-66单药、氟康唑单药及两药合用对诱导菌丝形成的影响，结果显示无论单药还是两药合用均不能抑制菌丝的形成。
5.利用荧光探针DCFH-DA测定了CZ-66单药、氟康唑单药以及CZ-66与氟康唑合用后对细胞内活性氧(ROS)的影响。结果发现CZ-66与氟康唑合用比单药作用下的细胞内ROS水平显著升高，加入抗氧化剂Vc和谷胱甘肽后，CZ-66与氟康唑合用的杀菌有所减弱，证明CZ-66协同氟康唑的杀菌作用部分依赖于ROS的升高。
6.真菌细胞壁疏水性考察发现，CZ-66与氟康唑合用后白念珠菌细胞壁表面疏水性发生显著变化，透射电镜观察显示，两药合用后真菌细胞壁和细胞膜出现严重损伤，提示CZ-66与氟康唑导致真菌的细胞壁和细胞膜损伤，发挥协同杀真菌作用。
7.为了探究CZ-66的作用靶点，本课题利用DARTS的实验方法，考察与CZ-66相互作用的靶点蛋白。通过探索CZ-66与白念珠菌总蛋白作用的实验条件，包括蛋白酶浓度、蛋白与药物作用时间，胶的浓度以及CZ-66的不同浓度。最终发现，加入10mM的CZ-66，在55-60kD的位置出现一个差异条带。对条带进行质谱鉴定，通过峰面积、分子量、蛋白生物信息学的分析和蛋白功能的分析，初步推断Cdc19p可能是CZ-66的作用靶点。之后，利用棋盘式微量液基稀释法在发酵碳源(葡萄糖、蔗糖、半乳糖等)培养基和非发酵碳源(甘油)培养基中进行体外抗真菌研究，发现在发酵碳源和非发酵碳源中均具有的协同抗真菌作用，但在非发酵碳源培养基中协同作用明显减弱，初步验证CZ-66可能通过影响Cdc19p的功能发挥抗真菌作用，具体的作用靶点和机制还需进一步研究。
结论：本课题通过吩嗪类衍生物和前期结构改造系列化合物的筛选，得到了与氟康唑协同的抗真菌的化合物CZ-66、FQ-12、FQ-17、FQ-18以及与卡泊芬净协同的硬脂酸单甘油酯。采用棋盘式微量液基稀释法，选用多种临床抗真菌常用药和CZ-66合用，发现与氮唑类有协同杀菌活性。CZ-66与氟康唑合用可以升高胞内ROS，同时导致白念珠菌细胞壁和细胞膜出现明显损伤，细胞表面疏水性改变。此外，为了进一步探讨CZ-66的作用靶点，本课题成功建立了CZ-66体外与白念珠菌蛋白作用的DARTS体系，并找到差异条带，质谱鉴定后，初步推断Cdc19p可能是CZ-66的作用靶点，但具体的作用机制还需进一步研究。