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在叶绿体中,光合作用的正常运转需要包括光系统I、光系统II和Ru Bis CO等在内的多种光合蛋白复合体的协同作用。核编码的叶绿体蛋白需要进入叶绿体,正确折叠及定位后来发挥功能。核编码光合作用相关的蛋白质中,如光合天线复合体LHC II是叶绿体类囊体中丰度最高的蛋白。在高等植物的叶绿体发育过程中,核编码光合作用相关蛋白的积累与稳态平衡的调控仍有大量未知领域有待研究。为阐明核编码的叶绿体蛋白实现稳态平衡调控,我们利用实验室前期经EMS（ethyl methane sulphonate mutagenesis）诱变筛选得到的一株叶色黄绿的拟南芥突变体pga1-1进行研究。pga1-1的突变位点基因编码叶绿体被膜蛋白AtFtsH12,属于定位于叶绿体内膜的Fts H家族成员。我们的研究结果如下:1.pga1-1的突变基因为AtFtsH12。构建两种二元表达载体p Cambia1300-p AtFtsH12:g AtFtsH12-GFP和p Cambia1300-p UBQ10:AtFtsH12,并对拟南芥叶色突变体pga1-1进行回复验证,确定了pga1-1的叶色表型确实是由基因AT1G79560/AtFtsH12发生突变导致的。pga1-1突变位点G703R位于AtFtsH12的ATPase结构域。2.AtFtsH12参与拟南芥叶绿体的发育调控。蓝绿温和胶（BN-PAGE）和二向电泳的结果发现,pga1-1中各光合蛋白复合体的积累量相较于野生型（WT）显著降低;2周龄植物的蛋白质免疫印迹检测进一步显示,pga1-1中光合蛋白亚基的稳态积累受到不同程度的抑制且捕光天线蛋白的积累受到的影响最大;在0-24 h植物去黄化的实验体系下,蛋白质免疫印迹结果表明,pga1-1叶绿体蛋白稳态积累速度严重下降。3.对制备且纯化后的AtFtsH12多克隆抗体进行了有效性验证。建立了p ET28a-p T7:AtFtsH12-Loop-His原核表达系统,通过IPTG诱导获得融合蛋白AtFtsH12-Loop-His。纯化了AtFtsH12-Loop-His蛋白并通过免疫家兔制备了AtFtsH12抗血清。利用抗原亲和纯化抗血清获得了高效的AtFtsH12多克隆抗体,并在WT、pga1-1和pga1-1的不同转基因回复植物株系的总蛋白中检测到了AtFtsH12-GFP以及内源的AtFtsH12。4.AtFtsH12在叶绿体被膜上形成较大的蛋白复合体。通过对回复植物pga1-1p AtFtsH12:g AtFtsH12-GFP叶肉细胞原生质体中荧光信号的观察,以及蔗糖密度梯度离心实验对内源AtFtsH12分布的检测,确定了拟南芥AtFtsH12定位在叶绿体被膜;BN-PAGE和二向电泳结果显示,AtFtsH12参与形成一个分子量远大于常见光合复合体的超复合体。q RT-PCR结果显示,pga1-1中AtFtsH12G703R蛋白积累水平上调,可能是由于其在转录本水平的上调导致的。BN-PAGE的结果发现,pga1-1中AtFtsH12G703R不影响其复合体的形成。AtFtsH12G703R的上调可能是pga1-1对其叶绿体发育缺陷的补偿性应答。5.AtFtsH12参与PEP复合体和PEP依赖的叶绿体基因的表达。q RT-PCR分析显示,在光形态建成过程中,pga1-1中由PEP催化转录的psb A和rbc L转录本的积累水平较WT有所降低,这表明光合蛋白的异常积累可能与叶绿体基因的表达降低有关;同时,突变体中编码NEP的rpo Tp的转录本与WT相比在24 h积累上调近一倍,而NEP催化转录的PEP核心亚基基因rpo B的表达则在RNA水平上只有略微下调,且编码PEP一个辅助亚基的p TAC2的积累则几乎不受影响。4天大植物的BN-PAGE和蛋白质免疫印迹结果显示,pga1-1中PEP复合体的积累较WT明显下降,这与PEP转录本在转录水平的下降相一致。上述结果共同说明,AtFtsH12与PEP复合体和PEP依赖的叶绿体基因的表达有关。6.AtFtsH12调控前体蛋白向叶绿体转运过程中的积累。酵母双杂交实验结果表明,AtFtsH12的Loop结构域与Lhc B2蛋白前体的N端直接互作。4周龄pga1-1中的荧光信号显示,标记在转运肽后的GFP蛋白不能完全进入叶绿体。杂交植物pga1-135S:FNRctp-GFP的荧光信号显示,在0 h到24 h植物去黄化过程中,FNRctp-GFP在叶绿体内积累严重下降。在4周龄pga1-1 35S:FNRctp-GFP植物原生质体中,细胞质中出现GFP信号积累。这表明AtFtsH12突变影响细胞质翻译前体蛋白在叶绿体内的积累。7.pga1-1引发细胞质蛋白应激反应和叶绿体UPR。q RT-PCR定量分析显示,pga1-1中细胞和叶绿体未折叠蛋白质反应的标志基因ct Hsp70和cp Hsp70在转录本水平和蛋白水平上相较于都发生了上调;与cp UPR相关的转录因子Hsf A2在转录本水平上也发生了上调;同时,蛋白酶Clp P1在pga1-1中的积累显著增加。这些结果共同说明,pga1-1中细胞质和叶绿体蛋白稳态平衡受到了影响。