【摘 要】
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大豆是重要的经济和油料作物,挖掘和鉴定影响油分含量和组分的功能基因对于改良大豆品质具有重要意义。有研究表明KASⅡ在拟南芥、花生、烟草和棉花中参与脂肪酸的积累,影响脂肪酸组分的变化。因此,本研究以拟南芥β-酮脂酰ACP合成酶基因为探针,在Soybase中进行Blast比对,发现大豆中共有11个β-酮脂酰ACP合成酶基因（GmKASII）,对这11个基因进行了生物信息学分析,并结合转录组测序和定量分
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大豆是重要的经济和油料作物,挖掘和鉴定影响油分含量和组分的功能基因对于改良大豆品质具有重要意义。有研究表明KASⅡ在拟南芥、花生、烟草和棉花中参与脂肪酸的积累,影响脂肪酸组分的变化。因此,本研究以拟南芥β-酮脂酰ACP合成酶基因为探针,在Soybase中进行Blast比对,发现大豆中共有11个β-酮脂酰ACP合成酶基因（GmKASII）,对这11个基因进行了生物信息学分析,并结合转录组测序和定量分析,选择了在种子中表达量最高的基因Glyma.17G047000在拟南芥和大豆中进行功能验证。发现Glyma.17G047000改变了脂肪酸组分,提高了硬脂酸和油酸含量。主要研究结果如下:1.在NCBI的GEN-BANK数据库中搜索查找拟南芥β-酮脂酰ACP合成酶（atkasⅡ）基因序列,以该基因为探针在Soybase中进行Blast比对,检索到大豆中共有11个GmKASⅡ基因,分为3个亚家族,其中Glyma.05G129600与Gly ma.08G084300;Glyma.05G218600与Glyma.08G024700;Glyma.10G041100与Glyma.13G12800互为三对同源基因;第一亚家族中Glyma.13G112700、Glyma.17G047000与棉花、拟南芥具有相同的功能结构域（GPNYSISTACATSNFCI）;。2.对GmKASⅡ家族基因启动子进行分析,发现GmKASⅡs启动子区均存在与激素相关、与光反应相关的顺式作用元件;除Glyma.13G112700、Glyma.13G128000、Glyma.05G129600外,其余基因均含有与逆境胁迫相关的响应元件。3.在籽粒发育不同时期（R5、R6、R7）的转录组数据库中检索11个GmK ASⅡ基因的表达情况,发现Glyma.05G129600、Glyma.08G084300、Glyma.13G112700、Glyma.17G047000在大豆籽粒中有较高的表达,且Glyma.17G047000在R5、R6、R7时期表达量都是最高的;对GmKASⅡs基因进行时空表达特异性分析,q RT-PCR结果显示GmKAS-A（Glyma.17G047000）在各个组织中都有明显的表达;并且GmKASⅡs基因在大豆胚成熟时期的表达量均呈现先上升后下降的趋势,在20 d的胚中表达量是最高的。4.结合RNA-seq、实时荧光定量PCR结果,选择四个基因（Glyma.05G129600、Glyma.08G084300、Glyma.13G112700、Glyma.17G047000）构建了GFP融合表达载体,在烟草下表皮细胞和拟南芥原生质体中的定位实验表明,这四个基因均定位在叶绿体上。5.结合RNA-seq及q RT-PCR实验结果,构建植物表达载体,在拟南芥中过表达GmKASⅡ-A（Glyma.17G047000）基因;获得了3个表达量较高的T3代转基因拟南芥株系;利用气相色谱法检测脂肪酸含量:与野生型相比,过表达GmKASⅡ-A基因的拟南芥株系棕榈酸显著降低;硬脂酸含量显著提高,其中1个过表达株系（OE-3）极显著提高了3.36%;油酸含量均有所提高,OE-1、OE-3分别极显著提高了4.65%、5.29%;亚油酸、亚麻酸含量均有所降低。6.利用农杆菌介导的大豆子叶节方法,在大豆中过表达内源基因GmKASⅡ-A（Glyma.17G047000）,共获得1个T1代阳性株系。利用索氏提取法,检测出转GmKASⅡ-A基因大豆总油分含量显著提高2.52%;气相色谱法分析T1代阳性株系籽粒中的脂肪酸各组分含量,发现棕榈酸C16:0含量显著性减低2.94%;硬脂酸C18:0含量显著性提高2.53%;油酸C18:1含量提高了5.41%;亚油酸、亚麻酸含量均不同程度减低,且亚麻酸含量降低幅度小于亚油酸。
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