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【研究目的】复发/难治弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者预后非常差。大剂量化疗联合自体造血干细胞移植（ASCT）是复发/难治DLBCL治疗的经典挽救性方案,但只有26-64%的患者可获得缓解,近一半的患者缓解后出现再次复发。近年来CART治疗在复发/难治DLBCL的治疗中取得非常显著的疗效,但经CART治疗缓解的患者仍有40-50%出现复发或进展。为提高复发/难治DLBCL疗效,本课题探究了ASCT后桥接CART（ASCT-CART）治疗复发/难治DLBCL患者疗效,并与单用ASCT治疗比较。基于ASCT-CART治疗复发/难治DLBCL的疗效显著,拟进一步将CAR基因转入造血干细胞（HSC）,形成表达CAR的HSC（CAR-HSC）,在动物体内探究CAR-HSC的造血重建和分化及其治疗DLBCL的疗效和安全性。【研究方法】1、临床研究研究纳入了2016-2021年在海军军医大学第一附属医院血液内科接受单纯自体造血干细胞移植（ASCT）或ASCT桥接CART（ASCT-CART）治疗的复发/难治DLBCL患者70人,其中接受ASCT-CART治疗24人,接受单纯ASCT治疗46人。纳入的患者包括经标准R-CHOP方案化疗6疗程或标准R-CHOP方案化疗4疗程和二线方案化疗2疗程未达CR的患者;以及治疗达CR或PR后在12月内出现复发或进展的患者。研究中涉及的二分类资料采用卡方检验,计量资料采用t检验,生存资料采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验。P＜0.05认为有统计学差异。2、基础研究（1）干细胞分选和CAR基因转染:通过磁珠分选小鼠骨髓造血干细胞后,采用携带CAR基因的慢病毒载体转染造血干细胞,形成CAR-HSC,通过流式细胞术检测CAR-HSC转染效率。（2）干细胞分化和造血重建:通过CAR-HSC体外集落形成实验探究CAR-HSC集落形成能力;通过监测CAR-HSC自体移植后外周血细胞比例和CAR阳性的免疫细胞比例,明确CAR-HSC在小鼠体内分化和造血功能重建能力。（3）ASCT模型的建立:采用CD45.1表型的C57/BL6N小鼠作为供体,CD45.2表型的C57/BL6N小鼠作为受体。受体采用致死剂量Co60辐照清髓预处理后,回输供体造血干细胞。通过监测小鼠造血恢复和嵌合率（CD45.1阳性细胞比例）评估小鼠ASCT模型是否成功。（4）DLBCL模型:采用免疫源性较低的小鼠黑色素瘤细胞系B16作为载体细胞,过表达人CD19分子,构建B16-CD19细胞。通过B16-CD19细胞皮下种植成瘤,构建类似于人DLBCL的小鼠肿瘤模型。（5）CAR-HSC自体移植治疗DLBCL模型:受体小鼠接受Co60辐照后,皮下种植B16-CD19肿瘤细胞,然后回输CAR-HSC,通过观察肿瘤增长速度和小鼠生存情况,评估CAR-HSC疗效;通过检测外周血细胞因子,评估CAR-HSC细胞因子释放综合征等毒副作用;通过流式细胞术和免疫组化检测肿瘤中浸润的免疫细胞,明确CAR-HSC分化产生的CAR阳性免疫细胞对肿瘤微环境重塑作用。【结果】1、临床研究中,ASCT-CART组和ASCT组复发/难治DLBCL患者,完全缓解率分别为75%和33%（P=0.001）,部分缓解率17%和57%（P=0.001）。ASCT-CART和ASCT组患者3年无进展生存（PFS）为81%和44%（P=0.032）。ASCT-CART和ASCT组患者3年总体生存（OS）分别为80%和69%（P=0.541）。ASCT-CART和ASCT组3年累积复发率分别为15%和56%（P=0.013）。2、基础研究中,ASCT后,全骨髓细胞对照组（BMC）、GFP-HSC对照组和CAR-HSC实验组自体移植后4周内,小鼠造血均恢复。BMC组、GFP-HSC组和CAR-HSC组小鼠嵌合率分别为89.80±0.31%、91.65±1.62%和88.80±3.02%,三组小鼠嵌合无明显差异（P=0.606）,说明慢病毒转染和CAR表达不影响HSC造血重建。3、ASCT后,BMC、GFP-HSC和CAR-HSC组小鼠B细胞比例分别为49.28%±1.78%、49.63±3.69%和31.80%±1.58%。CAR-HSC组小鼠B细胞比例显著低于BMC组（P=0.001）和GFP-HSC组（P=0.001）。BMC、GFP-HSC和CAR-HSC组小鼠中性粒细胞比例分别为13.18%±1.42%、19.78%±2.31%和36.73%±4.45%。CAR-HSC组中性粒细胞比例显著高于BMC组（P＜0.0001）和GFP-HSC组（P=0.02）。其他免疫细胞包括T细胞、NK细胞和单核细胞,三组间无显著差异。4、CAR-HSC移植后,CAR阳性细胞比例为9.34%±2.02%。在CAR阳性细胞中,CAR-T细胞占比为5.17±2.10%,CAR-NK细胞比例为13.79±4.27%,CAR-B细胞比例为6.27±1.98%,CAR-M占比为15.48±2.82%,CAR-Gran占比为46.63±14.27%。5、CAR-HSC治疗DLBCL模型,未转染的HSC作为对照组（CTRL）。移植后21天CTRL组和CAR-HSC组肿瘤内浸润的免疫细胞比例分别为24.20%±4.79%和27.3%±3.70%（P=0.610）。肿瘤组织内CAR基因m RNA水平检测结果显示,CAR-HSC组CAR基因m RNA水平明显高于CTRL组（P=0.015）,说明表达CAR的免疫细胞可浸润到肿瘤组织。6、流式细胞术检测CTRL组和CAR-HSC组肿瘤组织中CD3阳性T细胞比例分别为25.58±4.45%和16.17%±3.68%（P=0.312）。通过RT-PCR检测肿瘤组织中CD4和CD8m RNA水平结果显示,CAR-HSC组CD8/CD4 m RNA水平显著高于CTRL组（P=0.036）。7、流式细胞术检测肿瘤相关巨噬细胞（TAM）比例和亚型,CTRL组和CAR-HSC组TAM比例分别为4.36%±2.16%和6.23%±1.26%（P=0.483）。CTRL组和CAR-HSC组M2/M1比例分别为1.68%±0.23%和0.94%±0.16%（P=0.009）;8、CTRL组和CAR-HSC组肿瘤相关中性粒细胞（TAN）比例分别为10.49%±1.80%和32.57%±5.71%（P=0.005）;9、免疫组化检测CTRL组和CAR-HSC组肿瘤中免疫细胞CAR-HSC组CD8阳性T细胞比例显著高于对照组（P=0.027）。肿瘤浸润的TAM中,CAR-HSC组M2型TAM显著低于CTRL组（P=0.027）,而M1型TAM比例显著高于对照组（P=0.001）。CAR-HSC组TAN比例显著高于对照组（P=0.040）;10、CAR-HSC组小鼠肿瘤体积增长速度显著慢于CTRL组（P=0.048）。CTRL组和CAR-HSC组小鼠中位生存时间分别为22（95%CI 17-26）天和25（95%CI 24-25）天。CAR-HSC组小鼠总体生存时间较CTRL组小鼠生存显著延长（P=0.029）。【结论】临床研究中,与单纯ASCT治疗相比,ASCT-CART治疗复发/难治DLBCL患者CR率显著提高,PFS显著延长,累积复发率显著降低。ASCT-CART治疗复发/难治DLBCL的疗效优于传统的单纯ASCT。动物研究中,慢病毒转染的CAR修饰后的HSC,不影响HSC体内分化和造血重建功能。CAR-HSC行ASCT治疗DLBCL模型,可重塑肿瘤微环境,有利于免疫细胞对肿瘤的杀伤,减缓肿瘤生长速度,显著延长小鼠生存时间,且无严重治疗相关并发症。