1研究目的本文通过收集大量临床数据资料进行挖掘分析,随访中医药治疗RA患者有无发生终点事件的情况,探讨RA患者血清血小板的变化及关联规则聚类分析以及健脾单元疗法改善类风湿关节炎患者血小板活化及免疫炎症。通过体外实验,观察炎症免疫指标、细胞因子、缺氧诱导因子、基质金属蛋白酶、VEGF/SDF-1/CXCR4通路指标的变化,探讨新风胶囊抑制RA的血小板活化、免疫炎症的作用机制。2研究方法2.1队列研究运用队列研究方法,随访安徽省中医院出院的RA患者,询问出院服用中药或中成药的时间,及有无手术治疗、关节外病变、全因死亡及再发加重入院等终点事件发生,填写《RA患者终点事件问卷》(CRF表)。统计学分析中医药与终点事件之间的相关性。2.2临床数据挖掘研究数据库中筛选出安徽省中医院风湿免疫科所需RA患者的病历资料。分析实验室指标的变化,分析健脾化湿通络中药与实验室检查指标变化之间的关系,复杂网络技术分析核心处方情况,描述性分析内服中药频次,聚类分析和关联规则分析健脾化湿通络中药与实验室检查指标的变化规律。依据是否使用新风胶囊内服和芙蓉膏外敷将患者分为单元疗法组(中药+新风胶囊+芙蓉膏)和单纯中药组(单纯内服中药),分析两种疗法与实验室指标之间的关系。利用随机行走模型对单元疗法组RA患者的血小板计数(PLT)及血沉(ESR)、超敏C反应蛋白(Hs-CRP)进行评价。2.3体外实验研究选取22例RA患者和6例健康人,分别收集外周血10ml,分离出PBMC,收集对数期细胞。实验分为五组:Ⅰ组(正常对照组:健康人的PBMC与血小板共培养),Ⅱ组(模型对照组:RA患者PBMC与血小板共培养),Ⅲ组(XFC组:含有最佳浓度XFC的RA患者PBMC与血小板共培养),Ⅳ组(XFC+AMD3100组:含有最佳浓度XFC和AMD3100的PBMC与血小板共培养),V组(AMD3100组:含有AMD3100的RA患者PBMC与血小板共培养)。采用MTT法检测细胞增殖情况,ELISA法检测TNF-ɑ、IL-1β、IL-4、IL-10、VEGFA及VEGFR的表达,实时定量PCR(qT-PCR)法检测SDF-1、CXCR4、HIF-1ɑ、HIF-2ɑ的表达,Western blot法检测SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR、MMP9蛋白的表达,免疫荧光法检测CD40L、PDGF、VEGF的蛋白表达。采用SPSS 21.0分析处理实验室指标。3结果3.1队列研究3.1.1一般情况完成随访的RA患者1468例,失访率18.98%;男性216例,女性1252例,平均年龄(53.09±13.11)岁。随访成功者按中药应用时间分组,分别为高暴露组943例,年龄(52.83±13.33)岁;中暴露组187例,年龄(53.63±11.88)岁;低暴露组162例,年龄(51.55±13.58)岁;非暴露组176例,年龄((55.22±12.51)岁。各组之间在年龄上无统计学差异(P>0.05)。病程方面,非暴露组与各个暴露组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.1.2中成药及中药方剂种类随访成功的患者使用中成药10种,总频次3765次,服用时间0.1~52个月,平均(14.28±13.81)个月;中药汤剂10种,总频次3182次,时间0.1~53个月,平均(9.20±10.75)个月。3.1.3各暴露组应用中药的情况,根据患者中药使用情况,经统计,使用最多的前12味中药可按功效分为四组:清热药(白花蛇舌草、蒲公英、紫花地丁)、活血药(丹参、桃仁、红花)、健脾药(茯苓、薏苡仁、陈皮)、祛风湿药(川芎、威灵仙、桑寄生)。3.1.4终点事件的情况共有80例终点事件的发生,再发入院43例,关节外病变18例,手术治疗10例,全因死亡9例。3.1.5终点事件的单因素及多因素logistic回归分析单因素χ~2检验提示,暴露强度与终点事件之间比较,差异有统计学意义(P<0.01)。多因素logistic回归分析提示,新风胶囊、健脾药及活血药的应用,是终点事件的保护性因素,提示足强度的中医药干预治疗,能减少RA患者的终点事件的发生。3.2临床数据挖掘研究3.2.1 RA患者PLT参数值1951例RA患者PLT值下降的有252例(占13%),正常的有893例(占46%),上升的有806例(占41%),PDW值下降的有33例(1.69%),正常的有1680例(86.11%),上升的有238例(12.20%),MPV值上升的有64例(3.28%,正常的有1721例(88.21%),下降的有166例(8.51%),PCT值上升的有17例(0.87%),正常的有1227例(62.89%),下降的有707例(36.24%),P-LCR值上升的有18例(0.92%),正常的有1414例(72.48%),下降的有519例(26.60%)。3.2.2 RA患者血小板参数与免疫炎症代谢指标的相关性分析PLT与ESR、PT、IGG、IGA、C4呈正相关,与C3呈负相关;PDW与C4、TT、ESR、IGA、ApoA1、WBC呈正相关,与C3、SOD呈负相关;MPV与HDL-C、CRP呈正相关,与SOD呈负相关;PCT与SOD、IGA、TG、C4、TC呈正相关;P-LCR与CRP、TT呈正相关,与SOD呈负相关,与其它指标及年龄、病程无相关性。3.2.3 RA患者血小板参数与免疫炎症代谢指标的关联分析关联分析最低支持度20%,最低置信度70%。PLT的升高与RF、hs-CRP、IG、PT、C4、TG的升高具有关联性,PCT、PDW的升高与hs-CRP、ESR的升高之间有关联,MPV升高与ESR升高、HDL-C下降具有关联,P-LCR的升高与hs-CRP的升高有关联性。3.2.4 RA患者PLT参数与实验室指标的logistics回归分析Logistics回归分析提示:PLT与IGM、hs-CRP、Apo-A1、IGA、Apo-B呈正相关,MPV与IGA、SOD、TG、ESR呈正相关,PDW与C4、ESR、IGM呈正相关,PCT与TG、hs-CRP、IgA呈正相关,P-LCR与TC、C4、Apo-B、TG呈正相关。3.2.5治疗前后实验室指标变化情况1951例RA患者的血小板参数(PLT、PDW、MPV、PCT、P-LCR)、免疫指标(C3、C4、IgA、IgM、IgG)、炎症指标(ESR、hs-CRP、RF、WBC)、代谢指标(SOD、TG、TC、HDL-C、LDL-C)治疗前后变化,治疗后患者的血小板参数PLT、PCT,免疫指标补体C3、C4、IgA、IgM、IgG,炎症指标血沉(ESR)、C-反应蛋白(hs-CRP)、类风湿因子(RF)均有所降低(P<0.05)。3.2.6中药使用情况及与实验室指标的关联聚类分析关联度最高的前5位分别为:鸡血藤、茯苓关联于PLT指标下降,鸡血藤&蒲公英&丹参关联于hs-CRP下降,蛇舌草&薏苡仁关联于ESR下降,薏苡仁&独活关联于IgM下降,茯苓&桃仁组合关联于PDW指标上升。聚类分析使用频次前20位药物,聚1类:红花、桃仁、陈皮、茯苓、薏苡仁、丹参、威灵仙、山药、豨莶草,聚2类:白花蛇舌草、蒲公英、鸡血藤、泽泻,聚3类:黄柏、知母、狗脊、牛膝、伸筋草,聚4类:独活、黄芩。3.2.7健脾单元疗法治疗RA患者一般情况3977例类风湿关节炎患者符合要求,单纯中药组为2011例,单元疗法组为1966例。3.2.8两组RA患者实验室检查的指标情况与本组治疗前相比,单元疗法组指标PLT、PDW、MPV、PCT、P-LCR、C3、IgA、RF、Hs-CRP的结果下降。单纯中药组的指标PLT、PDW、MPV、PCT、P-LCR、C3、C4、IgA、RF、Hs-CRP的结果下降。治疗后两组相比较,单元疗法组在降低PLT、PDW、MPV、P-LCR、C4、IgA、IgG、RF、Hs-CRP等指标差异更为显著。3.2.9随机行走模型分析单元疗法组的PLT、ESR、Hs-CRP综合评价的正向递增率分别为0.0654、0.2561、0.3126,每正向行走一步综合改善率分别为11.95%、49.86%、58.34%。单纯中药组指标PLT、ESR、Hs-CRP综合评价的正向递增率分别为0.0135、0.2120、0.2512,每正向行走一步综合改善率分别为2.53%、44.01%、48.83%。3.3体外实验研究3.3.1 XFC对RA患者的细胞因子和VEGF的影响与正常组相比,模型组TNF-ɑ、IL-1β、VEGF-A、VEGFR升高,IL-4、IL-10降低(P<0.01);与模型组相比,给予药物干预后各组TNF-ɑ、IL-1β、VEGF-A、VEGFR降低,IL-4、IL-10升高(P<0.01);与XFC组相比,AMD3100组TNF-ɑ、IL-1、VEGF、VEGFR降低,XFC+AMD3100组TNF-ɑ、IL-1β、VEGF-A、VEGFR降低,IL-10升高(P<0.01);与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组TNF-ɑ、IL-1、EGF-A、VEGFR降低,IL-4、IL-10升高(P<0.01)。3.3.2 XFC对RA患者外周血单核细胞SDF-1、CXCR4、VEGF、HIF-ɑ的m RNA影响与正常组相比较,模型组SDF-1、CXCR4、VEGF、HIF-1ɑ、HIF-2ɑmRNA升高(P<0.01);与模型组相比,各药物组SDF-1、CXCR4、VEGF、HIF-1ɑ、HIF-2ɑ降低(P<0.05,P<0.01);与XFC组相比,XFC+AMD3100组VEGF、SDF-1、CXCR4、HIF-1ɑ、HIF-2ɑm RNA下降;与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组VEGF、SDF-1、CXCR4、HIF-1ɑ、HIF-2ɑm RNA下降(P<0.01)。3.3.3 XFC对RA患者外周血单核细胞VEGF/SDF-1/CXCR4信号通路相关蛋白的影响与正常组相比,模型组VEGF-A、VEGFR、SDF-1、CXCR4、MMP9升高(P<0.01);与模型组相比,XFC组VEGF-A、VEGFR、SDF-1、CXCR4、MMP9表达下降(P<0.05,P<0.01),AMD3100组VEGF-A、VEGFR、SDF-1、CXCR4、MMP9表达下降(P<0.05,P<0.01),XFC+AMD3100组VEGF-A、VEGFR、SDF-1、CXCR4、MMP9表达下降(P<0.05,P<0.01);与XFC组相比,AMD3100组、XFC+AMD3100组VEGF-A、VEGFR、SDF-1、CXCR4、MMP9蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),与AMD3100组相比,XFC+AMD3100组VEGF-A、VEGFR、SDF-1、CXCR4、MMP9蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。3.3.4免疫荧光免疫荧光结果显示:细胞荧光密度较高,CD40L(兔抗人)、PDGF-A(兔抗人)、VEGF(小鼠抗人)所标记的细胞核及细胞质呈现红色荧光,背景清晰且无特异性着色。XFC+AMD3100组呈现红色荧光细胞比例最少且强度最弱。4结论4.1中医药的应用能减少RA患者终点事件的发生,中医药的干预强度是终点事件的保护性因素。4.2 RA患者普遍有血小板计数升高,PLT活化对RA患者的炎症、代谢、免疫指标的紊乱有一定影响。4.3我院治疗RA患者以健脾化湿通络法为主,善用健脾化湿清热通络药物配伍,且与免疫指标、炎症指标下降有关联。我院风湿病科独创健脾单元疗法治疗RA,内服中药主要以健脾化湿药、活血通络药、祛风除湿药、清热解毒药为主,中成药为新风胶囊,外敷药为芙蓉膏。单元疗法治疗的患者的血小板参数及免疫炎症代谢指标的改善效果优于单纯使用中药内服。4.4 XFC具有类VEGF/SDF-1/CXCR4通路阻断剂样作用,能抑制RA患者血小板活化,其机制如下:(1)通过上调抑炎因子IL-4、IL-10,下调致炎因子TNF-ɑ、IL-1β,调节VEGF/SDF-1/CXCR4通路;(2)通过下调VEGF的表达,调节SDF-1/CXCR4信号通路,抑制血小板活化;(3)通过下调HIF-α,调节VEGF/SDF-1/CXCR4通路,抑制血小板活化。