[研究背景和目的]胃癌是全球最常见的癌症之一,在我国,胃癌在恶性肿瘤发病率和病死率中位居第二和第三。近年来,得益于手术、放疗、化疗以及靶向治疗的改善和突破,胃癌患者治疗后的存活率得到一定程度的改善,但五年存活率仍处于较低的水平,因此积极寻找新的胃癌分子标志物和治疗靶点、提高胃癌的早期诊断和治疗效果是当前胃癌研究的重点任务。CD73是由NT5E基因编码的被糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面的一种多功能跨膜糖蛋白,是细胞外嘌呤代谢通路中的限速酶之一。近年来的研究发现CD73有细胞外水解酶和非水解酶两种功能。CD73发挥水解酶功能可参与调控肿瘤细胞增殖、肿瘤新生血管形成、肿瘤免疫逃逸、抑制免疫反应等过程。而CD73的非水解酶功能则参与调控癌细胞的浸润和转移能力。CD73的表达水平在乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌和肝癌中都存在异常。然而关于CD73在胃癌发生发展中可能的作用和机制尚未明确。本研究首先以人胃癌细胞株作为实验对象,应用CD73水解酶活性检测、蛋白免疫印迹法(Western Blot)、实时荧光定量PCR、CCK-8实验、流式细胞术等方法研究了CD73特异性抑制剂APCP在体外对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响及其可能的机制,随后通过构建慢病毒载体shNT5E并转染胃癌细胞BGC-823细胞,在体内外研究干扰NT5E表达后对细胞增殖的影响,最后通过分析TCGA数据库中CD73在胃癌中的表达,探讨其临床意义,为研究CD73在胃癌发生发展中的作用及机制提供基础和方向。[方法]1、CD73特异性抑制剂APCP对胃癌细胞增殖的影响。应用CD73水解酶活性检测、Western Blot和荧光定量PCR检测4株胃癌细胞和胃粘膜上皮GES-1细胞的CD73水解酶活性、CD73蛋白表达和NT5E mRNA表达水平;应用APCP作用于胃癌BGC-823细胞,水解酶活性检测观察不同浓度APCP对细胞水解酶活性的影响,采用CCK-8、平板克隆形成实验观察不同浓度APCP对细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测100μM的APCP对细胞凋亡和周期的影响,采用Western Blot检测100μM的APCP对细胞CD73表达以及EGFR/PI3K表达的影响。2、慢病毒介导的shNT5E对胃癌增殖的影响。构建针对NT5E的shRNA慢病毒载体,转染胃癌BGC-823细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达判断转染效率;LV-shNT5E转染胃癌BGC-823细胞后,采用荧光定量PCR筛选干扰效率最佳的序列,采用CCK-8和平板克隆形成实验观察LV-shNT5E-1对细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测LV-shNT5E-1对细胞凋亡和周期的影响;嘌呤霉素筛选构建稳定转染慢病毒载体LV-shNT5E-1的BGC-823细胞,裸鼠皮下成瘤实验观察LVshNT5E-1对细胞在体内成瘤速度以及对增殖标志物Ki67表达的影响;CD73水解酶活性检测LV-shNT5E-1对细胞水解酶活性的影响,采用Western Blot检测LV-shNT5E-1对细胞CD73和EGFR/PI3K表达的影响。3、基于TCGA数据库分析CD73在胃癌中的表达及临床意义。从TCGA数据库中下载具有完整临床病理资料和随访资料的328例胃癌患者的CD73表达数据,对比胃癌组织和邻近正常组织CD73的表达差异;从328例胃癌患者中选取25对匹配的胃癌及邻近正常组织并分析CD73表达差异;采用单因素卡方检验,比较328例患者CD73的表达水平与临床病理数据的相关性;采用Kaplan-Meier法分析CD73表达水平与患者生存状况的相关性;单因素及多因素回归分析明确CD73是否是判断胃癌患者预后的危险因素。[结果]1、胃癌BGC-823细胞的水解酶活性、NT5E mRNA和蛋白表达均显著高于GES-1(P<0.01),胃癌MGC-803和SGC-7901细胞的水解酶活性、NT5E mRNA和蛋白表达与GES-1相比差异无显著性意义(P>0.05),胃癌AGS细胞的水解酶活性、NT5E mRNA和蛋白表达均显著低于GES-1(P<0.05);水解酶活性检测实验提示不同浓度的APCP能显著抑制BGC-823细胞的水解酶活性且呈剂量依赖性(P<0.05);CCK-8实验和平板克隆形成实验提示不同浓度的APCP能显著抑制BGC-823细胞的增殖和克隆形成能力且呈剂量依赖性(P<0.05);流式细胞术实验提示100μM的APCP能诱导细胞凋亡,且以早期凋亡为主(P<0.01);细胞周期实验提示100μM的APCP能使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.01);Western blot结果提示100μM的APCP能促进CD73表达、抑制EGFR/PI3K的表达(P<0.05)。2、成功构建慢病毒载体LV-shNT5E;转染胃癌BGC-823细胞后,荧光定量PCR结果显示与LV-shNC组相比,LV-shNT5E能显著抑制NT5E表达,其中LV-shNT5E-1干扰效率最佳(P<0.005);CCK-8实验和平板克隆形成实验结果显示,相比于LV-shNC,LV-shNT5E-1显著促进细胞增殖(P<0.01)和克隆形成(P<0.01);流式细胞术实验结果显示LVshNT5E-1组细胞凋亡率较LV-shNC组无明显改变(P>0.05);细胞周期实验结果显示LV-shNT5E-1组S期细胞比例较LV-shNC组明显增加(P<0.01)。裸鼠皮下瘤实验结果显示,LV-shNT5E-1组皮下瘤生长速度以及皮下瘤体积较LV-shNC组差别无显著性意义(P>0.05);免疫组化结果显示LV-shNT5E-1组裸鼠皮下瘤CD73的表达显著降低(P<0.01),而Ki67的表达显著增加(P<0.005)。水解酶检测实验结果显示,LV-shNT5E-1组的水解酶活性显著增强(P<0.005);Western blot结果提示LV-shNT5E-1能抑制CD73表达、促进EGFR/PI3K的表达(P<0.05)。3、通过对TCGA数据库的数据进行分析,发现CD73在胃癌标本(328例)中的表达高于邻近正常组织(25例)(P<0.01);25对配对样本中的胃癌组织CD73表达明显高于癌旁组织(P<0.01);CD73表达水平与临床病理特征的相关性分析结果显示,CD73高表达与AJCC临床分期(P=0.003)、T分期(P=0.038)、N分期(P<0.001)有显著相关,而与年龄(P=0.062)、性别(P=0.08)、肿瘤分级(P=0.392)、M分期(P=0.432)无明显相关性;生存分析结果显示,高表达CD73的患者总生存率显著低于低表达者(HR=1.507,Log-rank P<0.05);单因素Cox回归分析结果显示临床分期(P=0.001)、T分期(P=0.041)、N分期(P=0.009)、CD73表达(P=0.027)明显与增加的死亡风险有关,多因素Cox回归分析结果显示,高表达CD73(HR=1.443,95%CI=0.996-2.09,P=0.046)与临床分期(HR=1.404,95%CI=1.009-1.952,P=0.044)可作为判断胃癌预后的独立危险因素。[结论]1、胃癌细胞自身的CD73水解酶活性与CD73的表达呈正相关,CD73表达越高,水解酶活性越强;胃癌细胞之间CD73的水解酶活性与CD73的表达存在明显的差异性;2、APCP能抑制胃癌BGC-823细胞的水解酶活性和增殖,而LVshNT5E则促进了细胞的酶活性和增殖,这一过程的机制可能是水解酶活性的改变影响了EGFR/PI3K信号通路的表达进而调控细胞的增殖和凋亡;3、胃癌BGC-823细胞中CD73水解酶活性与CD73表达之间可能存在着“负反馈”效应;4、CD73在TCGA胃癌数据集中高表达,其高表达与患者预后不良相关,CD73高表达是判断胃癌患者预后的独立危险因素。[创新点]CD73与肿瘤的发生发展密切相关,在肿瘤的增殖、凋亡、免疫逃逸等过程中发挥重要作用,本研究应用分子生物学实验方法并结合TCGA数据库挖掘,分别研究了CD73的水解酶活性和CD73表达对胃癌BGC-823细胞增殖的影响,对胃癌BGC-823细胞CD73水解酶活性和表达的内在关联以及CD73在胃癌中表达的临床意义进行初步阐述,为CD73在胃癌中的研究奠定实验基础。