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实验目的：本研究旨在制备出质量可控的ACNP药物载体，并在体外研究纳米活性炭吸附丝裂霉素C（CBMC）、丝裂霉素C（MMC）、纳米活性炭（ACNP）对于人肝癌Huh-7肿瘤细胞和Huh-7肿瘤干细胞的抑制效果，并相互比较，探究ACNP作为抗肿瘤药物载体治疗肿瘤的可行性。实验方法：1.将购买的医用活性炭用球磨机球磨，再将球磨后的活性炭用含有双蒸水的自制沉降缸沉降，获取适当高度范围内的活性炭，进行冷冻干燥得到ACNP粉末，并利用透射电镜（TEM）以及原子力显微镜（AFM）测定其粒径和形态。2.制备MMC的标准溶液后在其最大吸收峰364nm处测定吸光度值，并绘制MMC的标准曲线。将ACNP与MMC以一定比例混合后分成相同的8个组别，利用超声振荡法使MMC吸附至ACNP上，在振荡至5、10、15、20、25、30、35及40分钟时分别取一个组别的混合物，高速离心使ACNP沉淀，测定上清液的吸光度值，利用上述MMC标准曲线测定上清中游离MMC的含量，并进一步推算出吸附至ACNP上的MMC含量，根据确定ACNP吸附MMC的最佳时间。再将ACNP和MMC以不同比例配比，超声振荡30分钟，每个不同配比组别均高速离心使ACNP沉淀，测定上清液的吸光度值，利用上述MMC标准曲线测定上清中游离MMC的含量，并进一步推算出吸附至ACNP上的MMC含量，根据结果算出吸附等温式，最终计算出ACNP吸附MMC的饱和吸附量，并确定两种成分的最佳吸附比例，之后的实验将以此比例制备标准化的CBMC。3.利用CD133-PE抗体筛选人肝癌Huh-7细胞系中表达CD133表面抗原的肿瘤干细胞，用含20ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF和2%B27的无血清DMEM/F12培养基进行培养。后对分选出来的肿瘤干细胞采用肿瘤干细胞诱导分化实验、生长增殖曲线实验、表面标志物鉴定实验、软琼脂克隆形成实验及免疫缺陷小鼠（NOD/SCID小鼠）体内成瘤实验等鉴定方法进行鉴定。4.在含有160μl密度为5×106个/ml的Huh-7肿瘤细胞和Huh-7肿瘤干细胞的96孔板中，加入MMC、ACNP、CBMC等三个药物组别，且每个组别设2.5、5、10、20、40、80μg/ml六个浓度组，加入后孵育24小时，利用CCK-8试剂盒测定不同浓度的，不同药物对于Huh-7肿瘤细胞和Huh-7肿瘤干细胞的抑制作用。实验结果：1.悬浮沉降法制备出来的ACNP溶液，经过冻干后获得黑色絮状的ACNP粉末。利用AFM与TEM测定其表征的结果显示，自制ACNP为近似球形，表面光滑，粒径均匀，大小为89.93±12.63nm。且该方法制备出来的不同批次的ACNP形状及质量非常稳定。2.测定出的MMC标准曲线方程为为D=0.00213+0.06942×C （R=0.9996，P<0.0001)；ACNP吸附MMC的最佳吸附时间为30分钟；Langmuir吸附等温方程为C/X=1.75048+0.0079×C （R=0.98236，P<0.0001），并由此方程计算出ACNP吸附MMC的饱和吸附量为126.58mg/g，因此之后实验中配制CBMC时采用的MMC与ACNP配制比例为1:8。3.采用流式细胞分选法，从人肝癌Huh-7细胞系中分选出了所占比例为5.18%的CD133+的肿瘤细胞，用包含20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF和2%B27的DMEM/F12培养基继续培养。分选出来的细胞中CD133+肿瘤干细胞比例高达92.81%；将分选后培养成球的Huh-7肿瘤干细胞在含血清的DMEM/F12培养基条件下培养，进行诱导分化可发现肿瘤干细胞迅速贴壁、分化，在48～72小时时肿瘤干细胞球完全贴壁、消失，形成与人肝癌Huh-7细胞系一样的单层肿瘤细胞；而肿瘤干细胞生长增殖曲线和软琼脂克隆形成实验则显示，分选出的CD133+肿瘤干细胞较其它非肿瘤干细胞具有更高的增殖活性，结果具有统计学意义；在NOD/SCID小鼠体内成瘤实验中分选出CD133+肿瘤干细胞的成瘤率为57%，而Huh-7肿瘤细胞的成瘤率为0，两种细胞致瘤能力有显著性差异，即CD133+的肿瘤干细胞较Huh-7肿瘤细胞具有高度的致瘤性。4.将终浓度为2.5、5、10、20、40、80μg/ml的MMC、ACNP和CBMC分别施用于人肝癌Huh-7肿瘤细胞和Huh-7肿瘤干细胞后根据结果可计算出MMC和CBMC对于抑制Huh-7肿瘤细胞的IC50值分别为10.28μg/ml、4.822μg/ml，而对于Huh-7肿瘤干细胞的IC50值分别为132.078μg/ml、56.83μg/ml。结果显示ACNP在各个剂量下对于Huh-7肿瘤细胞及Huh-7肿瘤干细胞均不具有抑制生长作用。MMC和CBMC在各个剂量下对于Huh-7肿瘤干细胞的抑制率均显著低于Huh-7肿瘤细胞，结果具有统计学意义，且随着剂量的增加其抑制率呈现增强的趋势。CBMC在各个剂量下对于Huh-7肿瘤细胞及Huh-7肿瘤干细胞的抑制率均显著高于单独使用的MMC和ACNP，即MMC将ACNP作为载体后可以有效提高对于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的抑制率，结果具有统计学意义，且随着剂量的增加其抑制率呈现增强的趋势。结论：1.本研究获得了质量稳定、可控的，粒径大小为89.93±12.63nm的ACNP。2.制备的ACNP吸附MMC的饱和吸附量为126.58mg/g，与MMC的最佳吸附比例为8:1，最佳吸附时间为30分钟。3.成功从人肝癌Huh-7细胞系中分选出了CD133+的Huh-7肿瘤细胞，分选后CD133+的Huh-7肿瘤细胞的纯度可达到92.81%，且通过肿瘤干细胞诱导分化实验、生长增殖曲线实验、软琼脂克隆形成实验、表面标志物鉴定实验和体内成瘤实验等鉴定方法对其进行鉴定，确认分选出的细胞为Huh-7肿瘤干细胞。4. MMC、CBMC在各个剂量下对于Huh-7肿瘤干细胞的抑制率均显著低于Huh-7肿瘤细胞，且随着剂量的增加其抑制率呈现增强的趋势，结果具有统计学意义。5. CBMC在各个剂量下对于Huh-7肿瘤细胞及Huh-7肿瘤干细胞的抑制率均显著高于单独使用的MMC和ACNP，即MMC将ACNP作为载体后可以有效提高对于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的抑制率，且随着剂量的增加其抑制率呈现增强的趋势，结果具有统计学意义。6. ACNP在各个剂量下对于Huh-7肿瘤细胞及Huh-7肿瘤干细胞均不具有抑制生长作用。