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自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是由于自身免疫反应异常所引起的慢性肝炎综合征。其主要病理特征为血清自身抗体阳性、高免疫球蛋白血症、肝细胞损害等,若不及时治疗,最终会发展成肝硬化、肝功能衰竭,严重者需进行肝脏移植甚至死亡,严重威胁人类健康。肝细胞凋亡是AIH重要病理特征,对AIH的疾病进程发挥重要作用。β-arrestin2作为一种多功能支架蛋白,可以调节Src家族酪氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶等多种信号通路,参与细胞活化、迁移、凋亡等过程。有研究表明,在酒精肝和胆管结扎诱导的肝损伤小鼠模型中,β-arrestin2通过抑制Akt通路,促进肝细胞凋亡从而加重疾病发展。然而,β-arrestin2在AIH发病过程中的作用及其对肝细胞凋亡的影响尚不清楚。目前,AIH临床可选择的治疗药物较少,虽然AIH对糖皮质激素等免疫抑制剂治疗的应答良好,但停药后病情极易反复或恶化,长期服用会引起代谢功能紊乱、器官损害等多种不良反应。因此,亟需开发新型治疗AIH药物或联合用药治疗策略,减少激素用量来减轻不良反应。本课题组前期研究结果表明,芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25）能作用于β-arrestin2有效缓解肝纤维化;CP-25可保护急性免疫性肝损伤小鼠,且具有较好的免疫调节作用。那么,CP-25联合较低剂量泼尼松（prednisone,Pre）能否发挥抗AIH作用?CP-25的作用机制是否与影响β-arrestin2的表达有关呢?为此,本课题在前期研究基础上,使用野生型（wild type,WT）C57BL/6J小鼠腹腔注射肝抗原（S-100）建立AIH小鼠模型,灌胃给予CP-25和Pre,在整体水平观察与单独给药相比,CP-25联合Pre对AIH的保护作用。同时,使用β-arrestin2-/-小鼠建立AIH小鼠模型,观察β-arrestin2基因敲除对AIH肝细胞凋亡的影响,以及其机制是否与调节Akt/糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）通路有关。体外分离培养小鼠原代肝细胞,用肿瘤坏死因子?（tumor necrosis factor?,TNF-?）刺激诱导肝细胞凋亡,观察β-arrestin2缺失对其的影响,并给予不同浓度CP-25,检测细胞凋亡率、凋亡相关蛋白表达及Akt/GSK-3β通路的变化,探讨CP-25改善AIH的可能机制。目的:分别使用WT C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠建立S-100诱导的AIH模型,观察CP-25、Pre单独及联合给药对AIH小鼠的保护作用,探讨β-arrestin2敲除对AIH肝细胞凋亡的影响。体外使用TNF-α刺激小鼠原代肝细胞,建立肝细胞凋亡的体外模型,探讨β-arrestin2基因缺失对Akt/GSK-3β凋亡通路的影响,同时给予CP-25,部分阐明其抑制肝细胞凋亡改善AIH的机制。方法:WT C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、AIH模型组、CP-25（50、100 mg/kg）单独给药组、Pre（4、8 mg/kg）单独给药组、CP-25（50、100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）联合给药组。从WT C57BL/6J小鼠肝内提取肝抗原S-100,使用新鲜制备的S-100与等量的完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）充分乳化后腹腔注射,诱导小鼠AIH模型。ELISA法检测小鼠血清抗核抗体（anti-nuclear antibody,ANA）,以及炎症因子TNF-?、白细胞介素6（interleukin 6,IL-6）水平,流式细胞术检测T细胞亚群变化。Td T介导的d UTP缺口末端标记法（Td T-mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL）检测肝细胞凋亡情况,Western blot法检测肝组织Bax、Bcl-2、活性Caspase-3、β-arrestin2、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表达变化。同时,使用β-arrestin2-/-小鼠建立S-100诱导的AIH模型,检测凋亡相关指标及Akt/GSK-3β通路蛋白的变化。体外分离培养小鼠原代肝细胞,使用TNF-α刺激,观察β-arrestin2基因缺失对肝细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达及Akt/GSK-3β信号通路激活的影响,并给予CP-25,观察上述指标变化。结果:1.CP-25联合Pre对S-100诱导的AIH小鼠病理及生化指标的影响HE结果显示,CP-25、Pre单独及联合给药均不同程度地减轻模型小鼠肝脏炎性细胞浸润,肝细胞肿胀和汇管区点柱状坏死明显减少。ELISA检测结果表明,与AIH模型组相比,CP-25（100 mg/kg）组、Pre（4、8 mg/kg）组、CP-25（50、100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）组转氨酶ALT、AST活性、自身抗体ANA水平,以及炎症因子TNF-α、IL-6水平均有不同程度的降低,CP-25（100 mg/kg）+Pre（4mg/kg）组与Pre（8 mg/kg）单独给药组降低更明显,且两组间无统计学差异。2.CP-25联合Pre对AIH小鼠脾脏T细胞亚群的影响流式细胞术检测结果显示,CP-25（100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）联合给药组小鼠脾脏CD4+、CD8+和Th17细胞比例的下降优于CP-25、Pre单独给药组;CP-25（100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）组Th1比例、Th1/Th2比率的下降、Treg比例的升高均优于Pre（4 mg/kg）组,与Pre（8 mg/kg）组相比,差异无显著性。Pre（8 mg/kg）、CP-25（100 mg/kg）单独给药组与联合给药组可不同程度降低AIH模型组升高的Th2细胞比例,给药组间差异无统计学意义。3.CP-25联合Pre对AIH小鼠肝细胞凋亡、凋亡相关通路及β-arrestin2表达的影响TUNEL检测结果发现,与正常组小鼠相比,AIH模型小鼠肝脏细胞凋亡率明显增加,给药组均可不同程度减少肝细胞凋亡,CP-25（100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）组与Pre（8 mg/kg）组减少更明显,两组间差异无显著性。Western blot和免疫荧光结果显示,与正常组小鼠相比,AIH模型小鼠肝脏Bax、活性Caspase-3、β-arrestin2表达明显升高,Bcl-2、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比例降低。与模型组相比,CP-25（100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）组与Pre（8 mg/kg）组Bax、活性Caspase-3表达降低明显,Bcl-2水平、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比例升高;CP-25（100mg/kg）+Pre（4 mg/kg）组与CP-25（100 mg/kg）组β-arrestin2降低明显。4.β-arrestin2基因敲除对S-100诱导的AIH小鼠的影响与WT模型组相比,β-arrestin2基因敲除小鼠肝脏炎性浸润明显减轻,血清转氨酶活性降低。Western blot结果显示,β-arrestin2-/-小鼠肝组织中促凋亡蛋白Bax、活性Caspase-3表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加,p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比例升高。5.体外β-arrestin2基因缺失对肝细胞凋亡及Akt/GSK-3β通路的影响体外分离WT和β-arrestin2-/-小鼠原代肝细胞,使用TNF-α刺激。流式细胞术检测结果显示,β-arrestin2基因缺失肝细胞凋亡明显降低;Western blot结果显示,β-arrestin2基因缺失明显抑制Bax蛋白表达,升高Bcl-2表达及p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β的比例。6.CP-25对肝细胞凋亡相关蛋白、Akt/GSK-3β通路及β-arrestin2表达的影响流式检测结果表明,TNF-α刺激可明显诱导肝细胞凋亡,体外给予CP-25(10-6、10-5 mol/L)可降低肝细胞凋亡率;Western blot结果显示,CP-25(10-6、10-5 mol/L)可明显降低肝细胞Bax蛋白表达,升高Bcl-2表达及p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β的比例,同时抑制β-arrestin2的表达。结论:1.与CP-25（100 mg/kg）、Pre（4 mg/kg）单独给药组相比,CP-25（100 mg/kg）+Pre（4 mg/kg）联合给药组转氨酶水平、自身抗体ANA、脏器指数以及炎性因子水平降低更明显,且效果与Pre（8 mg/kg）单独用药组差异无显著性。提示CP-25联合小剂量Pre对AIH的保护作用优于单独给药,与大剂量Pre达到相似效果。2.CP-25（100 mg/kg）联合给药组脾脏CD4+、CD8+、Th1/Th2和Th17细胞比例的下降、Treg细胞比例的升高与Pre（8 mg/kg）组比较,差异无显著性。同时,与单独给药组相比,CP-25（100 mg/kg）联合给药组明显降低肝细胞凋亡率、Bax、活性Caspase-3以及β-arrestin2表达,增加Bcl-2、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β表达。提示CP-25联合小剂量Pre可能通过调节T细胞亚群比例,恢复Akt/GSK-3β通路的激活抑制肝细胞凋亡,从而减轻AIH。3.与WT AIH小鼠相比,β-arrestin2-/-小鼠肝脏炎性细胞浸润明显减轻,细胞凋亡率、Bax和活性Caspase-3表达降低,Bcl-2、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β升高。体外β-arrestin2基因缺失可抑制TNF-α刺激引起的肝细胞凋亡及Bax水平,升高Bcl-2、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β表达。提示β-arrestin2基因敲除可促进Akt/GSK-3β通路的激活,从而抑制肝细胞凋亡,改善AIH的发生发展。4.体外给予CP-25后可降低肝细胞凋亡率,抑制Bax与β-arrestin2表达,促进Bcl-2、p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β表达。提示CP-25可能通过下调β-arrestin2水平,恢复Akt/GSK-3β通路的激活,从而抑制促凋亡蛋白的表达,减少肝细胞凋亡发挥缓解AIH的作用。