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宝山堇菜(Violabaoshanensis)是在中国南方发现的一种新的Cd超富集植物。从宝山堇菜中克隆Cd耐性相关基因的目的在于：(1)揭示宝山堇菜对Cd解毒和转运的分子机制；(2)提供更多候选基因用于改良植物的Cd耐性和富集性能。本论文研究工作主要包括：(1)调查宝山堇菜在不同生境下的重金属积累特征；(2)采用抑制消减杂交技术调查Cd处理(300μMCd，48h)宝山堇菜根的转录剖面(profile)，并对分离基因进行表达分析；(3)对部分基因进行全长cDNA扩增和原核表达分析；(4)对七个大环寡肽前体基因进行表达模式分析和酵母表达分析。取得的主要研究结果如下：
1.野外调查发现，四个样点的宝山堇菜地上部的Cd含量均高于100mg/kg，从样点1到样点4依次为826，230，32l和167mg/kg。样点3宝山堇菜Pb平均含量高于1000mg/kg，地上部和地下部的含量分别为2041和1305mg/kg。宝山堇菜地上部和根部的重金属含量与土壤总量显著相关(P<0.05，部分为P<0.01)。宝山堇菜Cd积累量与DTPA提取态Cd和土壤总Cd相关性系数分别为0.89(p<0.01)和0.68(p<0.01)。
2.溶液培养实验表明，在30μMCd(12d)处理条件下，宝山堇菜根部和地上部干重中的Cd积累量分别为27和352mg/kg；在300μMCd(12d)处理条件下，宝山堇菜根部和地下部干重中的Cd积累量分别为602和2595mg/kg，说明宝山堇菜能超富集Cd。100μMCd(40d)处理对宝山堇菜的生长没有明显的影响，说明宝山堇菜具有较强的Cd耐受能力。
3.从300μMCd处理宝山堇菜根中鉴定了43个表达序列标签(EST)。根据同源物的功能可将分离基因归为6类：抗氧化酶(6个EST)、蛋白代谢(9个EST)、信号转导(5个EST)、植物防卫肽(5个EST)、其它代谢(5个EST)以及功能未知蛋白(12个EST)。大部分分离基因为组成型表达，再次证实Cd超富集植物的Cd耐性主要依赖于植物的组成型防卫。
4.利用SMART-RACE技术对12个EST的cDNA末端进行了扩增，3’-RACE延伸cDNA末端的长度在97-550bp之间，5’-RACE则在37-1192bp之间。通过装配序列的阅读框分析以及编码蛋白的同源比对分析，鉴定了9个具有完全编码区的序列。其中5个序列编码不同的大环寡肽前体蛋白(Cyclotideprecursor，CP)，分别命名为VbCP1、VbCP2、VbCP3、VbCP4和VbCP5。另外4个序列分别编码小分子胁迫蛋白、GDP甘露糖焦磷酸化酶、翻译起始因子Suil和一个半胱氨酸丰富的小蛋白，依次命名为VbSP1、VbGmapase、VbSuil和Vb40。
5.将5个VbCP基因(VbCP1-VbCP5)和VbGmpase转化至大肠杆菌JM109中，VbCP1、VbCP3、VbCP4、VbCP5和VbGmpase的转化子表现出较对照(pQE40转化子)更强的Cd耐性。此外，重组蛋白VbCP4和VbGmpase在大肠杆菌M15[pREP4]中也获得了稳定的高表达。
6.分析5个VbCP基因(VbCP1-VbCP5)在宝山堇菜中的表达，发现这些基因在对照和Cd处理根中高表达，在叶中的表达相对较弱。电泳分析发现，在VbCP5的叶RT-PCR产物中，出现两组较VbCP5更长的DNA带。这两组DNA带被进一步鉴定为两个新的CP基因VbCP6和VbCP7，VbCP6和VbCP7主要在叶中表达，在根中未检测到它们的表达。
7.本研究定义大环寡肽的第1个Cys到第6个Cys之间的序列为六半胱氨酸框(Sixcysteineframe，SCF)。7个VbCP基因(VbCP1-VbCP7)编码的VbCP蛋白分别含有一个SCF(VbCP1-VbCP5)、两个SCF(VbCP6)或三个SCF(VbCP7)：7个VbCP蛋白的SCF长度包括4种类型：22aa(VbCP6和VbCP7)、24aa(VbCP1-VbCP3)、25aa(VbCP4)和28aa(VbCP5)。将Genbank蛋白数据库中的66个大环寡肽和26个CP进行SCF分析发现，VbCP4和VbCP5分别是仅有的含25-aa-SCF和28-aa-SCF的CP蛋白，VbCP6是仅有的含两个22-aa-SCF的CP蛋白，因而VbCP4、VbCP5和VbCP6代表了CP蛋白的三种新类型。大环寡肽和CP的SCF长度很少高于25aa，因而含28-aa-SCF的VbCP5也代表了一种稀有的CP类型。
8.将七个VbCP基因(VbCP1-VbCP7)转至酿酒酵母YL36中，分析不同转化子的重金属耐性。VbCP2、VbCP4、VbCP6和VbCP7转化子的Cu耐性高于其它转化子，VbCP4、VbCP6和VbCP7转化子的Zn和Cd耐性也轻微高于对照载体转化子。由于已有大环寡肽存在金属束缚位点的报道，结合本研究的实验结果得出结论：从宝山堇菜中鉴定的CP基因与植物重金属耐性有关，它们的编码大环寡肽可能代表一类新的金属束缚蛋白。