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研究背景与目的2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）的起因主要是胰岛素抵抗增加和/或胰岛素分泌受损导致的持续高血糖状态,并且在过去几十年已经成为一种全球流行病。目前针对T2DM的治疗主要包括手术、药物和非药物的方法。生酮饮食（ketogenic diet,KD）作为一种饮食干预方法被认为能有效改善T2DM的高血糖。但由于生酮饮食中的脂肪比例较高,也有研究指出其不良影响如脂肪堆积和肝脏纤维化。先前的研究报道Pescadillo1（PES1）与各种肿瘤有关,并有研究指出PES1可能与脂代谢有关,而T2DM与肿瘤的关系也被多次报道。然而,尚未有PES1调节T2DM相关脂质代谢以及KD对PES1影响的研究。本研究的目的是探讨PES1在KD对糖尿病小鼠影响中的作用及其介导的分子机制。方法（1）以胃癌患者为对照组,胃癌合并T2DM为病例组,肝脏样本的获取通过胃癌手术检查肝脏转移情况时的活检。qRT-PCR和Western blotting检测对照组和病例组肝脏中PES1基因转录的mRNA水平和PES1蛋白的表达水平。相关性分析探索T2DM病人的肝脏中PES1基因的表达与血清脂质关系。（2）正常健康小鼠（C57BL/6J）和T2DM小鼠（KKAy）分别用常规饲料和生酮饲料喂养干预16周（10-12只/组）。观察小鼠的一般特征情况如体重、血糖、饮食、饮水。并观察KD干预对T2DM小鼠葡萄糖耐量与胰岛素耐量的影响。测量血清和肝脏中的总胆固醇（total cholesterol,TC）和甘油三脂（triglycerides,TG）水平,H＆E和油红O染色观察肝脏脂质堆积情况。Western blotting检测脂质代谢相关蛋白的表达。（3）β羟基丁酸（β-HB）体外处理McArdle7777大鼠肝细胞以模拟KD在体内的作用。测定细胞和培养基中TC、TG水平,Western blotting检测β-HB处理细胞后对脂代谢相关蛋白表达的变化。免疫荧光实验检测细胞中PES1的表达与定位。ChIP实验探索Pes1基因表达的上游调控分子。（4）体外McArdle 7777大鼠肝细胞转染Pes1 siRNA,检测PES1在敲低后,细胞和培养基中的TC和TG水平,Western blotting检测PES1敲低对脂代谢相关蛋白的影响。（5）在过表达PES1的基础上用β-HB处理,检测McArdle 7777大鼠肝细胞和培养基中的TC和TG水平,Western blotting检测PES1过表达加β-HB处理对脂代谢相关蛋白的影响。（6）用CRISPR-cas9技术在小鼠肝脏内特异性敲除Pes1基因后,常规饲料喂养12周,检测血清和肝脏中的TC和TG,Western blotting检测肝脏中的脂质合成相关蛋白水平。（7）ChIP实验探索β-HB处理McArdle 7777大鼠肝细胞后,PES1调控p300基因表达的变化。CO-IP实验探索PES1在体外敲低和过表达以及在体内敲除的条件下p300与SREBP1c的结合情况。此外,用KD处理小鼠和β-HB处理细胞探索SREBP1c的乙酰化情况。（8）Western blotting 检测 KD 干预后小鼠肝脏中 NLRP3,Caspase1,GSDMD的蛋白表达。β-HB处理细胞、PES1体外敲低和过表达以及体内敲除情况下,检测上述蛋白水平。qRT-PCR检测上述小鼠肝脏和体外细胞中IL-1β和IL-18的mRNA水平。（9）体外McArdle 7777大鼠肝细胞中转染siRNA敲低Caspase1后,检测细胞和培养基中TG和TC水平,以及细胞中IL-1β和IL-18的mRNA水平。ChIP实验探究β-HB处理细胞后PES1与Caspase1基因启动子的结合情况。结果（1）Western blotting和qRT-PCR检测显示T2DM病人肝脏中的PES1蛋白和PES1基因表达水平相比对照明显升高。相关性分析发现T2DM病人肝脏中的PES1基因表达水平与血清中TG水平成显著正相关,而与TC、HDL-C、LDL-C的水平无明显相关性。（2）16周KD干预显著降低T2DM小鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗,以及肝脏和血清中的TG水平,而对TC水平无明显影响。Western blotting显示KD显著降低 C57BL/6J 和 KKAy 小鼠肝脏中 CHOP,PES1,p300,SREBP1c,FASN,SCD1的蛋白水平。然而对SREBP2蛋白的表达无明显影响。肝脏油红O染色和H＆E染色显示KD明显降低KKAy小鼠肝脏脂滴和脂肪空泡。（3）β-HB处理McArdle 7777大鼠肝细胞后,细胞和培养基中的TG水平显著降低,而TC水平无明显影响。Western blotting检测显示β-HB处理降低细胞中CHOP,PES1,p300,SREBP1c,FASN,SCD1蛋白水平。免疫荧光实验观察到β-HB降低核内PES1和SREBP1c的水平。（4）体外McArdle 7777大鼠肝细胞转染siRNA敲低Pes1后,细胞和培养基中的TG水平明显降低,而TC水平无明显改变,Western blotting检测显示PES1,p300,SREBP1c,FASN,SCD1的蛋白水平均显著降低。（5）体外McArdle 7777大鼠肝细胞中转染过表达Pes1质粒后,细胞和培养基中的TG水平呈现显著升高的趋势,而TC水平无明显变化,Western blotting检测显示PES1,p300,SREBP1c,FASN,SCD1的水平均明显升高,而在过表达PES1的基础上再用β-HB处理,所有升高均被明显削弱。（6）在小鼠肝脏中特异性敲除Pes1基因后,血清和肝脏中的TG水平明显下降,而TC水平无明显改变,同时Western blotting显示肝脏中的p300,SREBP1c,FASN,SCD1的水平均明显下降。这些结果与体外敲低Pes1的结果一致。（7）与此同时,qRT-PCR显示KD干预C57BL/6J和KKAy小鼠后肝脏中的IL-1β和IL-18的mRNA水平明显降低,Western blotting检测显示KD降低C57BL/6J和KKAy小鼠肝脏中NLRP3,Caspase1,GSDMD蛋白水平,这些结果与体外β-HB处理细胞实验的结果一致。（8）在体外敲低Pes1和体内敲除Pes1后,qRT-PCR显示细胞和小鼠肝脏中的IL-1β和IL-18的mRNA水平明显下降,Western blotting实验显示细胞和小鼠肝脏中的NLRP3,Caspase1,GSDMD蛋白水平均显著下调。这些结果与体外过表达Pes1的结果相反,而过表达Pes1加β-HB处理逆转了这些结果。（9）在McArdle7777大鼠肝细胞中转染siRNA敲低Caspase1后,细胞中IL-1β和IL-18的基因水平,以及Caspase1,GSDMD的蛋白水平均显著降低,同时细胞和培养基中的TG水平降低,而TC水平无变化。（10）机制研究揭示:β-HB降低CHOP结合到Pes1基因启动子上,从而降低PES1表达水平,导致p300与SREBP1c相互作用显著下降,进而明显降低SREBP1c的乙酰化（降低其转录因子活性）;此外,降低PES1结合到Caspase1基因启动子上,进一步降低炎症反应及其相关的TG水平。结论（1）2型糖尿病患者肝脏中PES1的高表达与血清中的甘油三脂异常显著相关。（2）KD可能通过下调肝脏中PES1介导的SREBP1c乙酰化和炎症通路改善2型糖尿病小鼠的脂质沉积。（3）该研究可能为了解2型糖尿病相关脂质失调的机制提供新的见解,并为2型糖尿病治疗提供新的药物靶点。