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第一部分Ghrelin抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞的分化目的：确定Ghrelin对血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的影响方法：分离、培养和鉴定小鼠血管平滑肌细胞,用10"6mol/L Ghrelin干预,0、24、48、72小时后,收集细胞及培养上清。以ALP检测试剂盒检测不同时间点细胞ALP的表达差异；观察矿化结节形成,并测定矿化结节的钙含量；以蛋白免疫印迹检测Runx2蛋白表达的差异。结果：Ghrelin干预血管平滑肌细胞后,与对照组相比,Ghrelin干预组中ALP的活性明显受到抑制,而且为时间依赖性,具体表现为24小时出现受抑制,48小时达到高峰。培养12天以后,Ghrelin抑制血管平滑肌细胞矿化结节的形成,对照组的钙含量显著高于Ghrelin干预组。两组的Runx2表达与ALP活性变化相似,在与Ghrelin共同培养的血管平滑肌细胞中,Runx2的表达显著低于对照组。结论：Ghrelin呈时间依赖性抑制ALP活性和Runx2表达,减少矿化结节的形成,提示Ghrelin抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。第二部分Ghrelin调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中的MAPK信号分子变化目的：探讨Ghrelin是否影响血管平滑肌细胞中的MAPK信号通路活性。方法：Ghrelin干预小鼠血管平滑肌细胞0、5、10、15、30和60分钟。分别提取细胞总蛋白,蛋白免疫印迹检测p-ERK、总ERK、 p-p38、总p38、p-JNK和总JNK的表达量。结果：Ghrelin干预5分钟时,可检测出微弱磷酸化ERK信号,随干预时间延长至10分钟、15分钟和30分钟,磷酸化ERK蛋白表达渐次增强,30分钟达到表达高峰,但一直无法检测到JNK和p38磷酸化信号。结论：Ghrelin激活血管平滑肌细胞MAPK-ERK信号通路活性。第三部分Ghrelin调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的细胞信号机制研究目的：探讨Ghrelin调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的信号传导途径与作用模式。方法：用RNA干扰(siRNA)技术阻断血管平滑肌细胞表达生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor, GHSR),用ERK信号通路阻断剂PD98059阻断ERK磷酸化,然后以10-6MGhrelin干预GHSR-siRNA组、阴性对照组、空白对照组及PD98059组的血管平滑肌细胞,同时以未用Ghrelin干预的阴性对照组、PD98059组、空白组做为对照,培养72小时后,应用蛋白免疫印迹检测p-ERK、ERK蛋白的表达以及测定各组ALP活性。结果：RNA干扰(siRNA)能成功沉默GHSR,在Ghrelin干预情况下,GHSR-siRNA组血管平滑肌细胞ERK磷酸化被显著抑制,而阴性对照组和空白对照组的血管平滑肌细胞ERK信号途径依然被激活。ERK信号通路阻断剂PD98059可以有效阻断Ghrelin干预后的ERK磷酸化。在Ghrelin干预情况下,阴性对照组和GHSR-siRNA组的ALP活性有统计学差异,阴性对照组明显低于GHSR-siRNA组(P<0.01),同时PD98059组及空白组的ALP活性有统计学差异,PD98059组显著高于空白组(P<0.01)。结论：Ghrelin通过激活ERK磷酸化抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞的分化。第四部分中层钙化动脉中GHSR-Ia、Runx2和Ghrelin的表达水平及相互关系目的：检测GHSR-Ia、Runx2和Ghrelin蛋白在中层钙化动脉和正常动脉中的表达水平,进一步探讨Ghrelin在调控动脉中层钙化中的病理机制。方法：采用Van Kossa银染色法证实动脉中层钙化的发生,使用免疫组织化学方法检测GHSR-Ia、Runx2和Ghrelin蛋白在钙化动脉和正常动脉中的表达水平。结果：在中层钙化的动脉中,GHSR-Ia表达下调和Runx2高表达同时存在。钙化动脉和正常动脉中的GHSR-Ia阳性表达有显著性差异(P<0.05),钙化动脉组明显低于未钙化组,Runx2阳性表达在两组间差异也有显著性(P<0.05),钙化动脉组明显高于于未钙化组,且GHSR-Ia和Runx2的阳性表达率呈负相关(P<0.01)。而Ghrelin在钙化动脉和未钙化动脉中的阳性表达率无明显差异(P>0.05),与GHSR-Ia、Runx2的表达无相关性(P>0.01)。结论：在中层钙化的动脉中,GHSR-Ia表达下调和Runx2高表达同时存在,提示GHSR-Ia表达下调与动脉中层钙化相关。