红梨果皮因花青苷的积累产生红艳的色泽,花青苷组分及含量随品种而变化。花青苷能抗氧化,对人体抗癌、抗变异等方面有重要作用,因此红梨具有较高的商品价值和较好的市场前景。目前,红梨花青苷合成的分子机理受到越来越多研究者的关注。花青苷的合成由一系列酶催化,编码这些酶的结构基因主要受到MYB、b HLH和WDR类蛋白形成的MBW复合体的调控,作用机制相对保守。光和激素都会对花青苷合成产生影响。bZIP转录因子是植物中广泛存在的一个转录因子家族,参与多种环境信号响应等生理过程。本研究通过以砂梨品种‘翠冠’梨的基因组为基础,系统分析了‘翠冠’梨PpbZIP转录因子家族的成员,进一步结合摘袋与套袋、Me JA处理的转录组表达谱挖掘了与花青苷积累关系密切的PpbZIP基因,最终利用生化及遗传手段对相关基因及蛋白复合体进行了初步的功能分析,主要成果如下:1.‘翠冠’梨PpbZIP家族成员鉴定及分析基于砂梨‘翠冠’基因组注释的基因序列,共鉴定得到104个PpbZIP家族成员。通过理化性质分析与亚细胞定位预测,发现‘翠冠’梨PpbZIP转录因子的蛋白序列平均长度约为326个氨基酸;等电点位于4.88-10.75之间;都定位于细胞核。按照拟南芥的分类标准,‘翠冠’梨PpbZIP转录因子可分为10个亚族,其中S亚族成员最多,B亚族最少,不存在K、L亚族的成员。bZIP保守结构域的分析表明‘翠冠’梨PpbZIP转录因子的该结构域存在明显保守性,同时也存在一定的多态性位点。系统发育分析、基因结构和motif分析显示,‘翠冠’梨PpbZIP转录因子的聚类与基因结构及motif存在相关性,聚类在一起的成员拥有相似的motif和基因结构。共线性分析表明,‘翠冠’梨PpbZIP基因主要通过基因复制扩增而来,串联复制仅有一对,并且基因对应的关系较为复杂,多对多关系最为普遍。进一步对PpbZIP基因的启动子区段进行顺式作用元件预测,发现存在TATA-box、G-box等关键元件,表明PpbZIP基因的表达可能会受到光照、激素等因素的诱导。本研究通过挖掘前期获得的转录组的数据,挖掘到2个表达受到光照及Me JA诱导的PpbZIP转录因子,可能参与调控光照、Me JA诱导的红梨花青苷积累过程,其中一个PpbZIP转录因子是与花青苷积累相关的拟南芥HY5同源蛋白,在本研究的后续内容中命名为Pp HY5。为了进一步验证Pp HY5的功能,我们光照处理过表达Pp HY5的‘茄梨’愈伤,并未出现明显的花青苷积累。这可能与Pp HY5无转录激活活性,促进花青苷积累依赖伴侣蛋白的大量积累有关,也暗示了Pp HY5可能通过与不同的蛋白互作在调控花青苷积累过程中扮演多面的角色。2.Pp HY5-Pp LHP1b-Pp CLFc负调控梨果皮花青苷积累的分子机制课题组在前期研究中通过以Pp HY5为诱饵蛋白筛选到了Pp HY5可能的互作蛋白Pp LHP1b。Pp LHP1b能识别H3K27me3修饰位点,招募复合体成员调控下游靶基因。酵母双杂、Pull-down的试验验证了Pp HY5与Pp LHP1b在体内外均能互作。进一步的研究表明,Pp LHP1b能与PRC2复合体成员Pp CLFc互作,但Pp CLFc不能与Pp HY5互作。这些结果说明LHP1可以作为桥梁,与Pp HY5结合后招募PRC2复合体的成员,调控下游靶基因的转录。为了初步研究Pp HY5-Pp LHP1b-Pp CLFc复合体的功能,本研究开展了Pp LHP1b的遗传转化试验,发现过表达Pp LHP1b能够抑制愈伤组织花青苷的积累,表明Pp LHP1b负调控花青苷的积累。为了进一步验证这个复合体是否参与调控花青苷积累过程,本研究对拟南芥clf的突变体开展了表型分析,发现该突变体中花青苷积累量明显高于野生型,表明CLF同样对花青苷积累存在负调控。综合蛋白互作结果与基因功能分析,本研究推测Pp HY5与Pp LHP1b互作后招募PRC2复合体成员Pp CLFc对正调控花青苷合成的靶基因座进行H3K27me3修饰,抑制基因的转录,从而负调控梨果皮花青苷的合成。本研究结果丰富了植物花青苷调控的分子生物学理论,而且能对改良红梨外观品质的分子育种提供理论基础。